Identificación y caracterización funcional de genes PMT relacionados con la glicosilación de proteínas en el hongo patógeno de frutos cítricos Penicillium digitatum

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Publication date
2013
Reading date
22-04-2013
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Abstract
En esta tesis se ha caracterizado el mecanismo de acción del péptido antifúngico PAF26 sobre S. cerevisiae como microorganismo modelo. Mediante microscopía confocal, se ha demostrado que PAF26 marcado fluorescentemente interactúa primero con las envueltas celulares, se internaliza en vacuolas y luego se libera al citoplasma coincidiendo con la muerte celular, de forma similar a lo observado en N. crassa. Se ha constatado que los dominios catiónicos e hidrofóbicos de PAF26 se requieren para su actividad, siendo el dominio catiónico necesario para su interacción y el dominio hidrofóbico para su internalización. El péptido se localizó principalmente en las vacuolas de la cepa resistente Δarg1, mutada en un gen del metabolismo de la arginina. Se ha demostrado que la actividad fungicida de PAF26 depende de una pared celular funcional ya que los protoplastos de levadura fueron menos sensibles al péptido. Por otro lado, se ha confirmado que cepas mutantes con deleciones en los genes de N- y O-glicosilación de proteínas EOS1 y PMT2 son resistentes a PAF26 y a otro AMP del tipo penetratina derivado de la histatina 5. Además, la mutación del gen EOS1 bloqueó la internalización del péptido y esta localización diferencial no cambió en protoplastos. Estos datos sugieren que Eos1p participaría en la glicosilación de proteínas de la pared celular necesarias para la internalización y por consiguiente actividad antifúngica de PAF26. Las manosiltransferasas de proteínas (PMT) catalizan la primera reacción de O glicosilación de proteínas y se han implicado en morfogénesis y virulencia de patógenos fúngicos, así como en la sensibilidad de S. cerevisiae a péptidos antifúgicos como acabamos de describir. Por ello, en esta tesis se han identificado los genes PMT en P. digitatum, encontrándose un miembro para cada una de las tres subfamilias. Las proteínas deducidas PdigPmt1p, PdigPmt2 y PdigPmt4p presentan los dominios conservados característicos de las PMT. Se demostró que PdigPMT2 es un ortólogo funcional de PMT2 de S. cerevisiae mediante ensayos de complementación funcional. Se analizaron los cambios de expresión de los genes PMT por PCR cuantitativa y se comprobó que se inducen durante el crecimiento in vitro del hongo e incluso bajo condiciones de estrés osmótico y oxidativo, y durante la infección sobre frutos cítricos. Por el contrario, los tres genes fueron fuertemente reprimidos en el hongo expuesto a PAF26. Para caracterizar la función de la familia PMT de P. digitatum se puso a punto la transformación genética de este hongo usando A. tumefaciens. Se obtuvieron varias cepas transformantes para la expresión constitutiva de los tres genes PMT y sólo un mutante con la deleción del gen PdigPMT2 (PDEH515). La caracterización fenotípica de PDEH515 reveló la importancia de PdigPMT2 en el crecimiento, conidiogénesis, sensibilidad a compuestos antifúngicos y virulencia de P. digitatum. Los conidios del mutante fueron resistentes a PAF26 confirmando que la glicosilación de proteínas determina la sensibilidad a péptidos antifúngicos en hongos. Se comprobó que PdigPMT2 es necesario para la completa virulencia de P. digitatum sobre frutos cítricos.
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