Aquesta tesi doctoral forma part de la investigació sobre l’evolució de la simbiosi en insectes realitzada durant molts anys pel grup de Genètica Evolutiva de la Universitat de València. L’organisme model utilitzat en aquest estudi és la panerola alemanya, Blattella germanica, un insecte omnívor i cosmopolita. La panerola alemanya posseeix dos simbionts: un endosimbiont, Blattabacterium, i una microbiota intestinal complexa. La funció de l’endosimbiont ha estat proposada prèviament com a la producció de metabòlits essencials mitjançant el reciclatge del nitrogen a través de la via ureolítica. Aquesta panerola comparteix la font d’aliment i l’ambient amb els humans, cosa que podria explicar les similituds de l’estructura de la seva microbiota intestinal amb la humana. Aquesta informació el converteix en un organisme interessant per estudiar tant els mecanismes evolutius després de l'obtenció de dos simbionts complexos, com l'estudi de la seva microbiota intestinal com a model per estudiar l'humà. Pel que fa al nostre estudi, l'objectiu principal de la tesi és entendre per què les paneroles tenen dos sistemes simbiòtics (Blattabacterium i la complexa microbiota intestinal) i si hi ha un "diàleg" entre ells i l'amfitrió. Per a aconseguir-ho, hem proposat tres objectius específics. Analitzar mitjançant assajos de complementació funcional en llevats si els transportadors suposats codificats al genoma del Blattabacterium (és a dir, gltP i glpF) són capaços de facilitar l’entrada de glutamina i urea a l’endosimbiont, analitzar la comunicació entre l’endosimbiont i la microbiota intestinal estudiant els canvis en els dos sistemes simbiòtics sota l’efecte d’un estrès (tractament antibiòtic) i analitzar mitjançant estudis meta-òmics de la microbiota intestinal a tres nivells diferents (metagenòmic, metatranscriptòmic i metaproteòmic) i desenvolupant una canalització per interpretar i integrar els resultats d’aquestes anàlisis. Per tal d’estudiar els transportadors que permeten la interconnexió metabòlica entre l’endosimbiont i l’hoste, vam clonar i provar les proteïnes transportadores propostes en llevat i vam realitzar assajos de complementació funcional per estudiar-ne la funció. Les proteïnes s’han de situar a la interfície de la membrana entre l’endosimbiont (Blattabacterium) i l’hoste (bacteriòcits). Aquestes proteïnes van ser seleccionades després de l'anàlisi del genoma de l'endosimbiont: les proteïnes GlpF i GltP van ser escollides com a opcions més plausibles per la seva estructura i propietats químiques. En aquest experiment es van analitzar les capacitats de transport, ubicació subcel·lular i nivells de transcripció i traducció de les suposades proteïnes clonades en llevats. Per estudiar la comunicació entre l’endosimbiont i la microbiota intestinal, hem realitzat un estudi en el qual avaluem els efectes d’un tractament amb antibiòtics (rifampicina) sobre la població d’endosimbionts, la distribució de la taxonomia de la microbiota intestinal i la forma física de l’hoste. La rifampicina és capaç de reduir la població d’endosimbionts quan es troba extracel·lularment durant la infecció dels ovaris, el mecanisme que solia transmetre’s verticalment. Vam tractar les paneroles amb rifampicina per obtenir organismes aposimbiòtics i vam estudiar els efectes d’aquesta reducció sobre l’estructura de la microbiota intestinal, analitzada mitjançant la seqüenciació del gen 16S rRNA i sobre l’hoste mesurant diversos paràmetres d’aptitud: pes, fecunditat, mortalitat i velocitat de desenvolupament . L’estudi de múltiples meta-òmics i el desenvolupament un programa per integrar les dades de meta-òmics es va desenvolupar juntament amb la Unitat de Bioinformàtica de l’Institut Robert Koch (Berlín, Alemanya). El programa es va anomenar gNOMO, ja que està dissenyat específicament per analitzar la microbiota d’organismes no models i la informació de l’amfitrió en paral·lel. Aquesta canalització inclou l’anàlisi de tres tècniques de meta-òmics: metagenòmica, metatranscriptòmica i metaproteòmica, i la seva integració, tant per a la microbiota com per a les dades de l’amfitrió. El seu disseny i flux de treball s’expliquen completament i també s’inclouen els resultats biològics d’interès obtinguts d’aquestes anàlisis: mostres de la microbiota intestinal en dos punts temporals de l’etapa adulta de les paneroles en situació de control per descriure la microbiota intestinal i entendre la seva funció.

This PhD thesis is part of the research on the evolution of symbiosis in insects carried out for many years by the Evolutionary Genetics group at the University of Valencia. The model organism used in this study is the German cockroach, Blattella germanica, an omnivorous and cosmopolitan insect. The German cockroach possesses two symbionts: an endosymbiont, Blattabacterium, and a complex gut microbiota. The function of the endosymbiont has been previously proposed as the production of essential metabolites by nitrogen recycling through the ureolytic pathway. This cockroach shares the food source and environment with humans, which could explain the similarities in the structure of its gut microbiota to the human one. This information makes it an interesting organism to study both the evolutionary mechanisms after the obtention of two complex symbionts, and the study of its gut microbiota as a model to study the human one. Regarding our study, the main objective of the thesis is to understand why cockroaches have two symbiotic systems (Blattabacterium, and the very complex gut microbiota) and if there is a "dialogue" between them and the host. To achieve it, we proposed three specific objectives. To analyze by functional complementation assays in yeast if the selected putative transporters encoded in the Blattabacterium’s genome (i.e., gltP and glpF) are able to facilitate the entry of glutamine and urea into the endosymbiont, to analyze the crosstalk between the endosymbiont and the gut microbiota by studying changes in the two symbiotic systems under the effect of a stress (antibiotic treatment), and to carry out meta-omics studies of the gut microbiota at three different levels (metagenomic, metatranscriptomic and metaproteomic), and to develop a pipeline to interpret and integrate these analyses’ results. In order to study the transporters that allow the metabolic crosstalk between the endosymbiont and the host, we cloned and tested the putative transporter proteins in yeast and performed functional complementation assays to study their function. The proteins must be located at the membrane interface between the endosymbiont (Blattabacterium) and the host (bacteriocytes). These proteins were selected after the analysis of the endosymbiont genome: the proteins GlpF and GltP were chosen as the most plausible options due to their structure and chemical properties. In this experiment the capabilities of transport, subcellular location, and levels of transcription and translation of the putative proteins cloned in yeast were analyzed. To study the crosstalk between the endosymbiont and the gut microbiota, we have performed a study in which we assess the effects of an antibiotic treatment (rifampicin) on the endosymbiont population, the gut microbiota taxonomy distribution, and the host fitness. Rifampicin is able to reduce the endosymbiont population when it is found extracellularly during the ovaries’ infection, the mechanism used to be transmitted vertically. We treated the cockroaches with rifampicin to obtain aposybiotic organisms and we studied the effects of this reduction on the gut microbiota structure, analyzed by 16S rRNA gene sequencing, and on the host by measuring several fitness parameters: weight, fecundity, mortality, and developmental speed. The multi meta-omics study and the pipeline development to integrate the meta-omics data was developed together with the Bioinformatics Unit of the Robert Koch Institute (Berlin, Germany). The software was named gNOMO, as it is designed specifically to analyze the microbiota of non-model organisms, and the host info in parallel. This pipeline includes the analysis of three meta-omics techniques: metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics, and its integration, both for the microbiota and the host data. Its design and workflow are fully explained and is also included the biological results of interest obtained from these analyses: samples of the gut microbiome at two time points of the adult stage of the cockroaches in control situation to describe the gut microbiome and understand its function.