1. Introducció La complexitat morfològica dels animals des dels seus plans corporals fins als seus apèndixs més xicotets i les funcions que els diferents òrgans i tipus cel•lulars són capaços de realizar, són el resultat d’un conjunt de processos finament coordinats que en conjunt constitueixen el desenvolupament. Comprendre aquestos processos, és a dir, comprendre com un òvul fertilitzat es converteix en un animal multicel•lular, és un dels majors reptes de la biologia. L’objectiu d’aquesta tesi és comprendre millor els mecanismes que controlen l’últim pas del desenvolupament, la diferenciació terminal, i com canvien a través de l’evolució. Durant la diferenciació, les cèl•lules restringeixen gradualment el seu potencial per convertir-se en diferents tipus cel•lulars. Generalment, les cèl•lules són considerades com a pluripotents fins l’etapa de la gastrulació; açò vol dir que tenen la capacitat de convertir-se en qualsevol tipus de cèl•lula de qualsevol de les tres capes embrionàries. Posteriorment, les cèl•lules travessen diferents etapes de disminució de multipotència. El terme “cèl•lula mare” es refereix a cèl•lules no diferenciades que són capaces d’autorenovar-se. Les cèl•lules mare específiques del teixit donen lloc a progenitors compromesos, generalment considerats com unipotents u oligopotents, capaços d’un nombre finit de divisions i que donen lloc a cèl•lules unipotents immadures que finalment maduren i es converteixen en cèl•lules terminalment diferenciades d’un tipus concret. Cada tipus cel•lular es caracteriza per expressar una combinació particular de gens efectors que són responsables de les seues propietats i comportaments únics. Per tant, el procés de diferenciació terminal consisteix fonalmentalment en la expressió coordinada d’aquestes combinacions específiques de gens. En la majoria de casos, les cèl•lules mai no adquiriran funcions adicionals o expressaran noves característiques una volta hagen començat a expressar gens específics de tipus cel•lular; sovint són postmitòtiques, com les neurones, o, si conserven la capacitat mitòtica, solament produiran cèl•lules de la seua classe (d’ací el terme “terminalment diferenciades”). Cada pas de la diferenciació cel•lular està mitjançat per la regulació espacial i temporal de milers de gens. Aquesta regulació sol integrar-se a través d’elements genòmics anomenats mòduls de regulació en cis (cis-regulatory modules, CRMs), que consisteixen normalment en grups de motius que són reconeguts per diverses proteïnes d’unió a ADN com els factors de transcripció (TFs). Els TFs són capaços de reconèixer seqüències curtes (6-12bp) i degenerades, a les que s’uneixen per tal d’activar la transcripció. No obstant això, la seua unió està condicionada per nombrosos factors com el posicionament dels nucleosomes, la compactació de la cromatina i les marques d’histones com H3K9me, un segell distintiu de l’heterocromatina. Els TFs són, al seu torn, els principals responsables de la distribució d’aquestes marques al genoma. Existeixen diversos tipus de CRMs; exemples típics inclouen els potenciadors (enhancers), que solen tindre un efecte positiu sobre la transcripció, els elements aïlladors (insulators), que restringeixen el rang d’activitat dels potenciadors, els silenciadors i els elements d’amarratge (tethering elements), que contribueixen a dirigir l’activitat d’un potenciador remot devers localitzacions específiques. Mitjançant la dissecció funcional de CRMs de gens efectors i l’avaluació de la seua expressió en diferents fons mutants s’ha demostrat que els gens específics d’un tipus de neurona solen dependre d’un xicotet grup de factors de transcripció. Aquestos factors de transcripció s’uneixen directament als motius de les regions cis-reguladores dels gens efectors i són necessaris per a l’inici i el manteniment de la seua expressió. La seua activació incial està regulada d’una manera complexa; es creu que integren entrades de TFs dependents del llinatge, així com altres senyals espai-temporals no autònomes. No obstant això, solen mantenir la seua expressió mitjançant autoregulació durant tota la vida de l’organisme. Els factors de transcripció que actuen d’aquesta manera s’han denominat selectors terminals (terminal selectors). En aquesta tesi s’estudia la diferenciació terminal del sistema serotoninèrgic de C. elegans. En particular, s’estudien els canvis en els programes de diferenciació terminal que van tenir lloc entre C. elegans i una altra espècie de Caenorhabditis, C. angaria, en VC4-5. Tant en C. elegans com a la majoria d’espècies pertanyents al gènere Caenorhabditis aquestes cèl•lules no són serotonèrgiques, mentre que en C. angaria es tenyeixen fortament amb anticossos anti-serotonina. En un altre treball s’estudia la diferenciació terminal de la neurona HSN; en particular, s’avalua el valor predictiu de la presència de llocs d’unió de TFs en els promotors gènics en quant a la seua activitat cis-reguladora en la neurona HSN. A més a més, s’avalua l’homologia molecular i regulatòria entre la HSN i les neurones serotoninèrgiques del rafe del ratolí. 2. Objectius Aquesta tesi consta de dues parts principals. A la primera part es pretenen estudiar els canvis evolutius produïts entre els llinatges de C. elegans i C. angaria en relació al fenotip serotoninèrgic de les motoneurones VC4 i VC5. Ens proposem identificar 1) quins gens de la via serotonina estan regulats diferencialment en VC4-5 en ambdues espècies (Objectiu 1.1), i 2) quins canvis en la lògica regulatòria són responsables d’aquests patrons d’expressió diferencial (Objectiu 1.2). El nostre propòsit general és augmentar el nostre coneixement sobre els mecanismes responsables de l’evolució de nous tipus cel•lulars. La segona part és un estudi computacional sobre la lògica reguladora de la motoneurona HSN. Al nostre laboratori s’identificaren sis TFs que orquesten la diferenciació terminal de la HSN actuant d’acord amb el model del “col•lectiu de TFs”. Els nostres objectius són, en primer lloc, avaluar la prevalença5555895 dels motius d’unió (TFBS) per als sis TFs en diferents grups de gens, d’acord amb el seu patró d’expressió (Objectiu 2.1). Esperem que els gens que es coneix que s’expressen a la neurona HSN tinguen una major probabilitat de tindre motius a la seua regió aigües amunt per a tots o la majoria dels sis TFs que regulen la diferenciació de la HSN. En segon lloc, pretenem utilitzar la presència d’aquests TFBS per tal de fer prediccions de novo sobre l’expressió gènica (és a dir, volem provar fins a quin punt el fet de tindre un conjunt de motius a la regió promotora prediu expressió a la neurona HSN) (Objectiu 2.2). Finalment, combinant aquest enfocament de cerca de TFBS amb altres mètodes, volem estudiar si la lògica regulatòria de la HSN es conserva a les neurones serotoninèrgiques del rafe del ratolí. (Objectiu 2.3). 3. Metodologia i resultats 1: H3K9me restringeix el fenotip serotoninèrgic en neurones VC4-5 de C. elegans Realitzàrem la immunotinció contra serotonina a la majoria d’espècies del gènere Caenorhabditis. Trobàrem que, a la majoria d’espècies, es conserva la identitat serotoninèrgica a la regió del cap, encara que existeix variació quantitativa al percentatge d’ADF, RIH i AIM positives per 5-HT. A la regió de la vulva trobem major variació. Una espècie (C. monodelphis) mancava de HSN serotoninèrgiques, i un grup de cinc espècies (C. angaria, C. castelli, C. quiockensis, C. sp. 8 i C. sp. 24) tenia VC4 i VC5 serotoninèrgiques, i un nombre variable d’altres neurones al cordó nerviós ventral (VNC). Atès que la serotonina en VC4- 5 no es troba en cap espècie fora del grup d’angaria, aquesta característica és una sinapomorfia d’aquest grup. 3.2. Conservació de la lògica de regulació transcripcional dels gens de la via 5- HT entre C. elegans i C. angaria A continuació, estudiàrem quin tipus de canvis regulatoris havien portat a aquesta divergència fenotípica en les VCs. En C. elegans existeixen dues classes de neurones serotoninèrgiques: les que sintetitzen 5-HT, que expressen els enzims necessaris per a la seua síntesi (tph-1, cat-4 i bas-1), com NSM, ADF i HSN, i les que l’incorporen del medi ambient (i expressen mod-5/SERT i cat- 1/VMAT amb aquest fi), que són RIH i les AIMs. Construírem reporters de GFP dels cinc gens de la via serotonina de C. angaria i els injectàrem en C. elegans. Solament el de cat-1 i el de mod-5 s’expressaren en VC4-5. També injectàrem reporters tph- 1, cat-1 i mod-5 en C. angaria i , encara que el nombre de nematodes que poguérem contar va ser molt baix, el reporter de mod- 5 fou l’únic expressat en CV4-5. Els resultats suggereixen que, en C. angaria, VC4 i VC5 han adquirit 5-HT a través de canvis en les regions cis-reguladores de mod-5. 3.3. Regulació transcripcional del cat-1/VMAT en C. elegans Com en C. elegans VC4-5 expressen cat-1 i el reporter de mod-5 de C. angaria també s’expressa en VC4-5 en C. elegans, ens plantejàrem la hipòtesi de que la regulació de cat- 1 en C. elegans podria ser similar a la regulació del fenotip serotoninèrgic de VC4- 5 en C. angaria; en conseqüència, l’estudi de la regulació del primer podria proporcionar informació sobre el segon. Per tal de trobar reguladores de l’activació transcripcional de cat- 1, adoptàrem una aproximació per candidats: seleccionàrem tots els factors de transcripció, així com alguns gens implicats en vies de senyalització rellevants que, segons WormBase, s’expressen en, o senyalitzen a, VC4- 5. Per a trobar la seua funcionalitat realitzàrem ARN d’interferència (RNAi) pel mètode de feeding contra aquestos gens en una soca sensibilitzada mutant per rrf-3 portador del transgèn otIs221 [cat- 1: : gfp]. Trobàrem que cat-1 està regulat per la via lin-3/EGF en VC4-5. UNC-4, un TF d’homeodomini que es troba aigües avall de lin-3/EGF, també és necessari per a la expressió cat-1 en VC4-5. També trobàrem que el factor de transcripció bHLH hlh-3 és necessari per a l’expressió de cat-1 en VC4-5. No obstant això, una anàlisi cis-reguladora del promotor mínim de cat-1 (una regió de 400 pb que resulta suficient per a la expressió d’un gen reporter específicament en VC4-5) no va revelar motius específics d’unió per a TFs. Al seu lloc, sembla que la major part de la regió conté informació rellevant per a la regulació de cat-1. 3.4 H3K9me reprimeix la recaptació de 5-HT en VC4-5 en C. elegans Els mutants amb disfunció en la metilació de Histona 3 lisina 9 (H3K9me) mostren expressió ectòpica del factor de transcripció unc-4, que normalment s’expressa en VC4 i 5, en VC1-3 i 6. Atès que es requereix unc-4 per a l’expressió de cat- 1 en VC4-5 en C. elegans, decidírem provar si la metilació de Histona 3 lisina 9 podia tindre algun paper en la repressió d’identitat serotoninèrgica en VC4-5 en C. elegans. Per tal de provar aquesta hipòtesi, realitzàrem tinció de serotonina en soques amb al•lels nuls per les histones metiltransferases met-1, met-2 i set-25, l’ortòleg de la Proteïna d’Heterocromatina 1 (HP1) del ratolí, hpl-2 i lin-61, una proteïna amb repeticions Malignant Brain Tumor (MBT). Quan aquests mutants es cultiven a 15ºC, presenten un percentatge de VC4-5 positives per 5-HT comparable al dels nematodes de genotip silvestre (p-valor > 0,05; prova de Chi quadrat i correcció de Bonferroni). No obstant això, quan es cultiven a 25ºC, el percentatje de VC4-5 positives per 5-HT augmenta, de mitjana, fins al 71% en mutants per a lin -61, 64% en hpl-2, 41% en met-2 i 19% en met-1. Per contra, els mutants per a set-25 no mostren un augment en la tinció de 5-HT. Mentre que met-1 i met-2 s’encarreguen de la mono- i di-metilació de H3K9, set-25 està involucrat en la tri-metilació i s’ha demostrat que els nivells de tri-metilació es correlen mal amb la unió al DNA de hpl-2. Per tant, els nostres resultats suggereixen que la identitat serotoninèrgica de VC4 i VC5 és reprimida activament en C. elegans per la mono- i di-metilació de H3K9. Curiosament, els mutants dobles hpl-1; hpl-2 mostren un alt percentatge de VC4-5 positiu de 5-HT a 15ºC. A continuació encreuàrem hpl-2(tm1489) i met-2 (4256) amb al•lels nuls mod-5 per a veure si el fenotip VC4-5 5-HT en mutants deficients de H3K9me també es deu a la recaptació de 5-HT. La tinció de 5-HT va mostrar una reducció signiticativa al comparar hpl-2(tm1489) amb mod-5(n822); met-2(4256). A més a més, l’encreuament dels mutants lin-61, hpl-2 i met-2 amb mutants les neurones HSN dels quals no sintetitzen serotonina, o amb mutants incapaços d’alliberar vesícules sinàptiques, també provoca una pèrdua de la tinció 5-HT en VC4-5. Aquests experiments mostren de manera convincent que, en mutants amb deficiència de metilació en H3K9. VC4-5, reabsorbeixen serotonina de les neurones HSN properes, de forma dependent del recaptador de serotonina mod-5/SERT. No obstant això, no poguérem detectar expressió mod-5 en VC4-5, malgrat que utiliztàrem diferents tipus de reporters, incloent els knock-in realitzats mitjançant CRISPR. 3.5 H3K9me és necessari de forma autònoma cel•lular per tal de reprimir la recaptació de 5-HT en VC4-5 en C. elegans. Els components de la maquinària de compactació de la cromatina hpl-2, met-2 i lin-61 estan amplament expressats i són bastant pleiotròpics. Per tant, era necessari avaluar si els efectes observats en VC4 i VC5 en mutants per a aquestos gens es devien a una activitat autònoma o no autònoma cel•lular d’aquestos. Per això realitzàrem experiments de rescat de mutants deficients de H3K9me amb promotors específics. Sobreexpressàrem les isoformes a i c de HPL-2, la isoforma a de LIN-61 i la única isoforma de MET-2 específicament en les VCs o HSNs (com a control) i realitzàrem immunotinció contra serotonina. En tots els casos, la sobreexpressió en VC4-5 reduí el percentatge de VC4-5 tenyides per 5-HT a nivells similars als dels nematodes silvestres, mentre que la sobreexpressió en HSN no tinguí efecte. 3.6 El període crític de VC4-5 per a tornar-se serotoninèrgiques en un fons genètic deficient en H3K9me és L4 Per tal d’escatir en quin punt del desenvolupament es requeria l’acció de H3K9me per a reprimir la identitat serotoninèrgica de VC4 i VC5 en C. elegans, aprofitàrem el fenotip sensible a la temperatura dels mutants de H3K9me. VC4 i VC5 són positives per a 5-HT en mutants hpl-2, lin-61 i met-2 quan els nematodes creixen a 25ºC però no quan ho fan a 15º. Realitzàrem una sèrie d’experiments de canvi de temperatura per tal de determinar la finestra de temps en què es requereixen aquestos factors. Mantinguérem les poblacions sincronitzades a 15ºC o 25ºC i cada 12h desplaçàvem (de 15ºC a 25ºC o al revés) una part de la població. A més, alguns nematodes es van mantenir a 25ºC només durant 24h. Trobàrem que, independentment de la quantitat total de temps passat a 25ºC, sols aquells nematodes que havien estat a 25ºC durant l’estadi L4 teníen VC4-5 positives per a 5-HT. Aquests experiments mostren que H3K9me durant L4, l’etapa en què maduren les neurones VC, és crítica per a la repressió del fenotip serotoninèrgic. 3.7 UNC-4 i HLH-3 són necessaris per a la tinció de 5-HT en VC4 i VC5 en mutants amb deficiència de H3K9me. D’acord amb el marc conceptual dels selectors terminals, s’espera que la majoria de les propietats específiques d’una cèl•lula estiguen regulades pel mateix conjunt de factors de transcripció. Com ja sabíem que UNC-4 i HLH-3 regulen l’expressió de cat-1 en VC4 i VC5, avaluàrem si eren necessaris per al fenotip 5-HT observat en mutants amb deficiència de formació d’heterocromatina. Encreuàrem mutants per a unc-4 i hlh-3 amb mutants per a lin-61. En els dos mutants dobles, VC4 i VC5 van perdre la seua tinció per a 5-HT en comparació amb els mutants simples LIN-61. 3.8. L’ablació amb làser de les neurones HSN elimina la tinció de serotonina en VC4-5 en C. angaria i C.elegans deficients en H3K9me. En resum, els nostres resultats fins ara inquen que: 1) En el grup de C. angaria, les neurones VC4 i VC5 han adquirit la capacitat de tenyir-se per a serotonina constitutivament, 2) En C. elegans, la tinció serotoninèrgica de VC4 i VC5 està restringida de forma autònoma cel•lular per metilació de H3K9. En mutants deficients en la maquinària relacionada amb H3K9me, VC4 i VC5 recapten 5-HT de les HSN properes per acció de mod-5/SERT. Per tant, el nostre següent objectiu va ser estudiar si, de la mateixa manera que en els mutants d’heterocromatina de C. elegans, la presència de serotonina en VC4 i VC5 en C. angaria depenia de la recaptació de 5-HT. L’expressió del reporter de mod-5 de C.angaria en C. elegans i C. angaria així ho indica. Atès que no hi ha soques mutants disponibles d’aquesta espècie, decidírem utilitzar una estratègia alternativa: si les neurones VC4 i VC5 en C. angaria reabsorbeixen 5-HT de la HSN veïna, aleshores l’ablació per làser d’aquestes cèl•lules hauria d’abolir la tinció per a serotonina de VC4 i VC5. Realitzàrem ablacions làser de les HSN a L1, molt abans de la seua diferenciació. En primer lloc, com a control positiu, realitzàrem l’ablació en mutants per a lin-61 de C. elegans. En aquestos nematodes, VC4-5 van perdre la seua tinció per a 5-HT. De manera similar, a les femelles de C. angaria sotmeses a l’ablació de HSN, la VC4 i la VC5 van perdre la seua tinció de serotonina, la qual cosa indica que VC4 i VC5 adquireixen la seua tinció al recaptar la serotonina alliberada per les HSN. 3.9. Rellevància funcional del fenotip serotoninèrgic de VC4-5 A més d’estudiar els canvis moleculars que condueixen al fenotip serotoninèrgic de VC4 i VC5 en el grup de C. angaria, ens interessa comprendre les implicacions funcionals d’aquest canvi evolutiu. VC4 i VC5, juntament amb les neurones HSN, són fonamentals per tal de controlar el comportament de la posada d’ous. Aquest comportament s’ha modelitzat com un procés de tres estats al qual la serotonina alliberada per les neurones HSN actua sobre les cèl•lules musculars vm1 i vm2 com a facilitador de l’estat actiu de posada, al qual els events de posada són altament probables, i l’acetilcolina alliberada per les neurones HSN i VC desencadenen els events individuals de posada. A més, s’ha demostrat que VC4 i VC5, així com les cèl•lules neurosecretadores uv1, inhibeixen l’activitat de les HSN, i les HSN activen les VC4 i VC5. S’ha demostrat que, en un medi de baixa osmolaritat, tant les HSN com VC4 i VC5 mostren una major freqüència de pics de calci, i la taxa de posada d’ous augmenta consegüentment, mentre que tant l’activitat de les HSNs i VCs com la posada d’ous són inhibides en medis d’elevada osmolaritat, com el M9. No obstant això, si s’anyadeix serotonina exògena al medi, la taxa de posada d’ous augmenta, indicant que la senyalització per 5-HT de la HSN indueix la posada d’ous. Es va avaluar la sensibilitat a la 5-HT de la HSN exògena en diverses espècies de Caenorhabditis; es van seleccionar algunes espècies del grup de C. elegans, com C. briggsae, algunes espècies del grup de C. drosophilae (C. sp. 2 i C. virilis), que es troben filogenèticament prop de C. angaria però no pertanyen al seu subgrup, i no mostren VC serotoninèrgiques, i totes les espècies del grup de C. angaria. Utilitzàrem un assaig molt estàndard per tal d’avaluar el comportament de posada d’ous: es deixa crèixer fins l’etapa adulta una població de nematodes sincronitzats (són adults de 24 hores aproximadament quan es realitza un assaig), i s’incuben durant 1 hora en pouets individuals amb M9 o M9 més 35mM de clorhidrat de 5-HT; després s’anota el nombre d’ous en cada pouet. Totes les espècies sense VC4 i VC5 serotoninèrgiques en els grups de C. elegans o de C. drosophilae van mostrar un augment evident de la taxa de posada d’ous després del tractament amb 5-HT exògen, amb una excepció. C. monodelphis no té neurones HSN serotoninèrgiques, per tant, és esperable que els músculs vulvals no responguen a la serotonina. Aquest és el cas. D’altra banda, el tractament amb 5-HT exògena en espècies dins del grup de angària no va tindre efecte (C. angaria soca RGD1 i C. sp. 8) o un efecte inhibidor (C. angaria soca PS1010, C. castelli, C. quickensis), amb l’excepció de C. sp. 24, al qual el tractament amb 5-HT també sembla que produïa un augment de la posada d’ous. No obstant això, aquesta espècie és particular perquè no solament té VC1-6 positives per a 5-HT, sinó també algunes neurones adicionals similars a les VCs i altres a la cúa. En general, el fenotip serotoninèrgic de les VCs sembla guardar una relació amb diferències en la funcionalitat del circuit de posada d’ous. 4. Metodologia i Resultats 2: Anàlisi bioinformàtic de la lògica cis-reguladora que controla la diferenciació terminal de les neurones HSN Per tal d’identificar la combinació de TFs que controla la diferenciació terminal de HSN, es va seguir una aproximació per gens candidats, seleccionant sis factors de transcripció que s’havia descrit que tenien un fenotip (egl) defectuós a la posada d’ous, relacionat amd defectes de la tinció de serotonina: el TF amb domini POU unc-86, el TF de dit de Zn tipus Spalt sem-4, el TF amb amb domini BHLH hlh-3, el TF de dit de Zinc de tipus Insm egl-46, el factor de transcripción ETS ast-1 i el factor GATA egl-18. Carla Lloret, estudiant de doctorat al laboratori, va caracteritzar l’expressió de diversos gens efectors als respectius fons mutants per als sis TF candidats. Va trobar que tots sis són necessaris per a la correcta diferenciació terminal de la HSN. A la vegada, Miren Maicas, investigadora post-doctoral al laboratori, va realitzar una extensa anàlisi de regulació cis de tres dels gens de la via de la serotonina, cat-1, tph-1 i bas-1. Mitjançant mutagènesi dirigida i EMSA, Miren va demostrar que aquests sis factors de transcripció s’uneixen directament als mòduls de regulació en cis (CRM) que controlen la transcripció dels gens de la via de la 5-HT. L’acció directa d’aquests 6 TFs sobre els gens efectors indica que es comporten com un col•lectiu de factors de transcripció per a orquestar la diferenciació de les neurones HSN. Basant-nos en aquestes dades experimentals, el nostre següent objectiu va ser analitzar si el col•lectiu de TFs de la HSN és capaç d’imposar una “signatura” o “empremta” reguladora en els gens expressats en la HSN que siga suficient per a distingir-los de la resta del genoma. 4.1. L’empremta reguladora de la HSN està sobrerepresentada als gens expressats en la HSN i pot utilitzar-se per tal de predir l’expressió gènica en HSN. Atès que els promotors de gens de la via 5-HT tenen motius d’unió per a tots o la majoria dels gens del col•lectiu de TFs de la HSN, plantejàrem la hipòtesi que, si el col•lectiu de TFs regula la transcripció de la majoria dels gens específics de la HSN, l’agrupació de llocs d’unió per a aquestos TFs hauria de tindre una probabilitat major d’ocurrir dins dels promotors o introns dels gens expressats en la HSN que a la resta del genoma. Es va realitzar una cerca en tot el genoma de la signatura regulatòria de la HSN, que es va definir com la presència de al menys un lloc putatiu per cadascun dels sis TFs, en una regió de 700 pb o menys. Trobàrem que la signatura de la HSN és més prevalent als gens que es sap que s’expressen en la HSN. A més a més, després de considerar la presència de l’empremta en altres espècies de Caenorhabditis (és a dir, la conservació de la signatura), augmentà l’enriquiment relatiu dels gens expressats en la HSN front a altres gens. Ens preguntàrem si la signatura de la HSN era suficient per tal de predir expressió de novo en la HSN. Es seleccionaren les regions promotores que porten la signatura regulatòria de la HSN de gens que havien sigut reportats com expressats en neurones, però no en HSN. El 37% d’elles es van expressar en HSN, mentre que cap de les 10 regions control (sense signatura) es va expressar en HSN. Per tant, la presència de la signatura de la HSN té cert poder predictiu amb respecte a l’expressió en HSN. No obstant això, sovint no n’és suficient; potser es requereixen motius adicionals, regles sintàctiques de disposició de motius, nombre de motius o propietats intrínseques de l’ADN per a l’expressió en la HSN. 4.2. Homologia profunda entre la HSN i les neurones serotoninèrgiques del rafe del ratolí Una volta caracteritzat el col•lectiu de TFs de la HSN i la prevalència de la firma regulatòria de la HSN en el genoma de C.elegans, es va tractar d’avaluar si la lògica regulatòria HSN es conservava en els mamífers. De fet, trobàrem que els ortòlegs de ratolí per a quatre dels sis TFs del col•lectiu HSN estaven involucrats en l’especificació serotoninèrgica de mamífers: el factor bHLH ASCL1, GATA2/3, INSM1 i el factor ETSS PET1, que són ortòlegs de hlh3, egl-18, egl-46 i ast-1, respectivament. A més a més, Laura Chirivella al laboratori va estudiar el patró d’expressió de BRN2, un factor de transcripció POU, ortòleg a UNC-86, que ha sigut associat amb l’especificació serotoninèrgica, i trobà que s’expressa en progenitors de neurones serotininèrgiques i en neurones serotoninèrgiques postmiòtiques a l’estadi embrionari E11.5, quan les neurones serotoninèrgiques s’estan diferenciant. També va estudiar el patró d’expressió de SALL2, l’ortòleg de ratolí més proper de SEM-4, i trobà que també s’expressa en progenitors de neurones serotoninèrgiques i en neurones postmiòtiques serotoninèrgiques en E11.5. Es plantejà la hipòtesi que, atès que la HSN i l’especificació de les neurones 5-HT de ratolí semblen estar regulades pel mateix conjunt de TFs, aquests dos tipus de neurones podrien compartir amples similituds moleculars i no a soles l’expressió dels gens de la via de la serotonina. Per tal de provar aquesta hipòtesi, integràrem l’atles neuronal de Hobert amb dades publicades d’ARN-seq de les neurones serotoninèrgiques del ratolí i realitzàrem una agrupació jeràrquica de la matriu d’expressió gènica resultant. El perfil d’expressió de HSN s’agrupà amb els nuclis serotoninègics del rafe amb un elevat soport de bootstrap. Considerant les similituds entre la HSN i el rafe del ratolí en quant al transcriptoma i al col•lectiu de TFs, a continuació analitzàrem si una signatura reguladora similar a la de la HSN podria estar present al genoma del ratolí. Trobàrem que les regions genòmiques del ratolí predites pel consorci ENCODE per a actuar com a enhancers al tronc de l’encèfal, que és on es troben les poblacions de neurones serotoninèrgiques, estan enriquides amb la signatura reguladora serotoninèrgica amb respecte als enhancers predits d’altres teixits no serotoninèrgics (p<0.05, regressió logística i prova HSD de Tukey). Concluïm que, de totes les neurones de C. elegans, el transtriptoma parcial de la HSN és molecularment el més proper al transcriptoma de les neurones serotoninèrgiques del rafe del ratolí, i que els enhancers actius en el mesencèfal estan enriquits en la signatura regulatòria serotoninèrgica en comparació amb els enhancers actius en altres teixits. Per tant, i tenint en compte també l’evidència experimental resumida anteriorment, les neurones HSN i les neurones 5-HT de ratolins comparteixen una homologia profunda. 5. Conclusions La identitat serotoninèrgica de VC4 i VC5 va evolucionar una volta dins del gènere Caenorhabditis, en el llinatge que va donar origen al grup angaria, compost per C. angaria, C. castelli, C. quiockensis, C.sp. 8 i C. sp. 24. El promotor de mod-5/SERT de C. angaria és capaç de dirigir la expressió d’un gen reporter en VC4 i VC5 tant en C.elegans com en C. angaria. Per tant, VC4 i VC5, en C. angaria, probablement recapta la serotonina, en lloc de sintetitzar-la. Canvis en el promotor mod-5/SERT són responsables dels canvis en la expressió de mod-5 entre C. angaria i C. elegans. El factor de transcripció UNC-4, de la família paired-like homedomain, i HLH-3, de la família bHLH, regulen la expressió del reporter de cat-1 en VC4 i VC5. Els mutants de C.elegans per a hpl-2, met-2 i lin-61, però no set-25, tenen un major percentatje de VC4 i VC5 positives per a 5-HT, la qual cosa també es deu a la recaptació de 5-HT. El requeriment d’aquestos gens per a la represió del fenotip 5-HT és autònom cel•lular. Atès que els mutants deficients en H3K9me de C.elegans tenen un fenotip en VC4 i VC5 similar al de C. angaria, els canvis en el promotor de mod-5 de C. angaria podrien estar relacionats amb canvis en el reclutament de factors de cromatina, el lloc de exclusivament als llocs d’unió per a FTs. La presència conjunta de llocs d’unió putatius per als sis TFs del col•lectiu de FTs que regula la diferenciació de la HSN (signatura o empremta regulatòria de la HSN) és més prevalent als gens que es sap que s’expressen en la HSN que a la resta del genoma. La conservació d’aquesta signatura en espècies del gènere Caenorhabditis augmenta l’enriquiment dels gens expressats en la HSN en comparació amb la resta del genoma. A més, la presència de la signatura de la HSN pot utilitzar-se per tal de predir l’expressió de reporters en HSN. Le neurona HSN presenta homologia molecular amb les neurones serotoninèrgiques del rafe del ratolí, però no amb altres poblacions neuronals de ratolins. A més, la signatura de HSN és lleugerament més prevalent en els enhancers anotats pel projecte ENCODE del cervell posterior del ratolí que en els enhancers actius en altres regions del cos.

1. Introduction The complexity of animal morphology, from body plans to the smallest appendage, and the functions that different organs and cell types are able to do, all arise from a set of tightly coordinated processes that together constitute development. Understanding these processes, i.e., understanding how a fertilized egg develops into a multicellular animal, has been acknowledged as one of the greatest challenges in biology. The aim of this thesis is to gain knowledge on the mechanisms controlling the final step of development, terminal differentiation and how they change through evolution. During differentiation, cells gradually restrict their potential to become different cell types. Usually, cells up to the step of gastrulation are regarded as pluripotent, which means that they have the potential to become any cell type in each of the three germ layers. Afterwards, cells traverse different stages of decreasing multipotency. The term ‘stem cell’ refers to undifferentiated cells that are capable of self-renewal. Tissue-specific stem cells are usually multipotent, such as haematopoietic stem cells, or unipotent, such as myosatellite cells of muscle. Tissue-specific stem cells give rise to committed progenitors, generally regarded as uni- or oligopotent, which are capable of a finite number of divisions and give rise to immature unipotent cells, which eventually maturate and become terminally differentiated cells of a given type. Each terminally differentiated cell type is defined by a particular combination of differentially expressed effector genes, which are responsible for its unique properties and behaviours. Therefore, the process of terminal differentiation consists in the coordinated expression of these specific combinations of genes. In most cases, cells will never acquire additional functions or express new features once they have begun to express cell-type specific genes; they are either postmitotic, as neurons, or, if they retain mitotic capacity, they will only produce more of their own kind, hence the term ‘terminally differentiated’. All the steps of cell differentiation are mediated by the spatial and temporal regulation of thousands of genes. This regulation is usually integrated through genomic elements called cis-regulatory modules (CRMs), which usually consist of clusters of short sequence motifs that are recognized by diverse DNA-binding proteins, such as transcription factors (TFs). TFs are able to recognize short (6-12bp) and degenerate sequences, to which they bind in order to activate transcription. However, their binding is conditioned by nucleosome positioning, chromatin compaction and histone marks, such as H3K9me, a hallmark of heterochromatin. TFs, in turn, are largely responsible for the distribution of these features in the genome. There are different kinds of CRMs; typical examples include enhancers, which have a positive effect on transcription (at least part of the time), insulators, which restrict the range of enhancer, silencers or tethering elements, which contribute to directing a remote enhancer activity towards a specific gene. Based on analysis of CRMs of effector genes, and on assessment of effector gene expression in different mutant backgrounds, it has been shown that neuron type-specific genes are usually co-regulated by a small group of transcription factors. These transcription factors bind directly to motifs in cis-regulatory regions of effector genes, and are required for the initiation and maintenance of their expression. Their own initial activation is regulated in a complex way; they are thought to integrate inputs from lineage-dependent TFs as well as other spatio-temporal non-autonomous cues. However, they usually maintain their expression via self-regulation during the entire organism life. Transcription factors acting in such a way have been termed terminal selectors. Terminal selectors act in combinations: the same TF can act as a terminal selector in different neuron types with very different sets of effector genes, but TF combinations are unique for each neuron subtype. The ability of a TF to activate different sets of genes in different cells is often attained through cooperative activation of gene expression. In this thesis we study terminal differentiation of C. elegans serotonergic system. Particularly, we study changes in terminal differentiation programs that took place between C. elegans and another Caenorhabditis species, C. angaria, in VC4-5. In C. elegans and other species, these cells are not serotonergic, whereas in C. angaria they stain strongly for serotonin. In another work, we study terminal differentiation of the HSN neuron, particularly, we assess how TF binding sites in gene promoters can predict cis-regulatory activity in the HSN neuron and we assess molecular and regulatory homology between HSN and mouse raphe serotonergic neurons. 2. Objectives This thesis has two main parts. In the first part, we aim to study the evolutionary changes that took place between C. elegans and C. angaria regarding serotonergic phenotype of VC4 and VC5 motorneurons. We seek to identify 1) which genes (serotonin pathway genes) are differentially regulated in VC4-5 in both species (Objective 1.1), and 2) which changes in regulatory logic are responsible for these differential expression patterns (Objective 1.2). Our global purpose is to gain insight into the mechanisms of cell type evolution. The second part is a computational study on the regulatory logic of the HSN motor neuron. In our laboratory it was found that a transcription factor collective of six TFs orchestrates HSN terminal differentiation. Our objectives are, in the first place, to assess the prevalence of TF binding motifs for the six TFs in different groups of genes, according to their expression pattern (Objective 2.1). We expect that genes known to be expressed in the HSN neuron are more likely to bear motifs in their upstream region for all or most of the six TFs regulating HSN differentiation. In the second place, we aim to use the presence of these TFBS to make de novo predictions on gene expression (i.e., we want to test the extent to which having a set of motifs in the promoter region predicts expression in the HSN neuron) (Objective 2.2). Finally, by combining this TFBS finding approach with other methods, we want to test whether the HSN regulatory logic is conserved in mouse raphe serotonergic neurons (Objective 2.3). 3. Methodology and Results 1: H3K9me restrains serotonergic phenotype in C. elegans VC4-5 neurons 3.1 Serotonergic system diversity in the Caenorhabditis genus We performed serotonin-immunostaining in most species of the Caenorhabditis genus. We found that , serotonergic identity in the head region is mostly conserved, although quantitative variation was found between species in the percentage of ADF, RIH and AIM that were 5-HT positive. In the vulva region, we found higher variability. One species (C. monodelphis) lacked serotonergic HSNs, and a group of five species (C. angaria, C. castelli, C. quiockensis, C. sp. 8 and C. sp. 24) had serotonergic VC4 and VC5, and a variable number of other VNC neurons. Since VC4-5 5-HT is not found outside the angaria group, this feature is a synapomorphy of this group. 3.2 Conservation of transcriptional regulatory logic of 5-HT pathway genes between C. elegans and C. angaria. Next, we aimed to understand which kind of regulatory changes had led to this VC divergent phenotype. In the nematode C. elegans there are two classes of serotonergic neurons, the ones synthesizing 5-HT, which express the enzymes required for serotonin synthesis (tph-1, cat-4 and bas-1), such as NSM, ADF and HSN, and the ones that incorporate 5-HT from the environment (and express mod-5/SERT and cat-1/VMAT for this purpose), which are RIH and AIMs. We built GFP reporters of the C. angaria serotonin pathway genes and injected them into C. elegans. Only cat-1 and mod-5 were expressed in VC4-5. We also injected tph-1, cat-1 and mod-5 reporters in C. angaria, and, although the number of worms we were able to score was very low, mod-5 reporter was the only one expressed in VC4-5. Altogether these results suggest C. angaria VC4 and VC5 have acquired 5-HT staining through changes in the mod-5 cis regulatory regions. 3.3 Transcriptional regulation of cat-1/VMAT in C. elegans As C. elegans VC4-5 express cat-1 and C. angaria mod-5 reporter is also expressed in C. elegans VC4-5, we hypothesized that the regulation of cat-1 in C. elegans could be similar to the regulation of C. angaria VC4-5 fully serotonergic phenotype and, consequently, studying the regulation of the former could provide information about the latter. In order to find regulators of cat-1 transcriptional activation, we undertook a candidate approach: we selected all transcription factors, as well as some genes involved in relevant signalling pathways that, according to WormBase, are expressed in, or signal to, VC4-5. To test for functionality, we performed interference RNA (RNAi) by feeding against them in an rrf-3 mutant sensitized strain carrying the otIs221[cat-1::gfp] transgene. We found that cat-1 is regulated by the lin-3/EGF pathway in VC4-5. UNC-4, a paired-like homeodomain TF, which is downstream of lin-3/EGF, is also required for cat-1 expression in VC4-5. We also found that bHLH TF hlh-3 is required for cat-1 expression in VC4-5. However, a thorough cis-regulatory analysis of the cat-1 minimal promoter (a 400bp region that drives expression specifically in VC4-5), did not reveal specific TF binding motifs. Instead, most of the region seems to bear relevant regulatory information. 3.4 H3K9me restrains 5-HT reuptake in C. elegans VC4-5 It has been reported that mutants with dysfunction in Histone 3 lysine 9 methylation (H3K9me) show ectopic expression of unc-4 transcription factor, which is normally expressed in VC4 and 5, in VC1-3 and 6. Since unc-4 is required for cat-1 expression in C. elegans VC4-5, we decided to test if Histone 3 lysine 9 methylation was important to restrain 5-HT fate in VC4 and VC5 in C. elegans. To test this hypothesis we performed serotonin staining in strains carrying predicted null alleles for histone methyltransferases met-1, met-2 and set-25, the ortholog of mouse Heterochromatin Protein 1 (HP1), hpl-2,and lin-61, a Malignant Brain Tumor (MBT) protein. When these mutants are grown at 15ºC, they show a percentage of 5-HT positive VC4-5 comparable to that of wildtype worms (p-value > 0.05; chi-squared test and Bonferroni correction). However, when they are grown at 25ºC, the percentage of 5-HT positive VC4-5 increases, on average, up to 71% in lin-61, 64% in hpl-2, 41% in met-2 and 19% in met-1 mutants. On the contrary, set-25 mutants show no increase in 5-HT staining. While met-1 and met-2 are in charge of mono- and di- methylation of H3K9, set-25 is involved in tri-methylation and it has been shown that tri-methylation levels correlate poorly with hpl-2 binding. Thus our results suggest VC4 and VC5 serotonergic fate is actively repressed in C. elegans by mono and di- methylation of H3K9. Interestingly, hpl-1; hpl-2 double mutants show a high percentage of 5-HT positive VC4-5 at 15ºC. Next, we crossed hpl-2(tm1489) and met-2(4256) to mod-5 null alleles, to see whether VC4-5 5-HT phenotype in H3K9me deficient mutants is also due to 5-HT reuptake. 5-HT staining showed a significant reduction when comparing hpl-2(tm1489) to mod-5(n822); hpl-2(tm1489) or mod-5(knu383); hpl-2(tm1489), or met-2(4256) to mod-5(n822);met-2(4256). Additionally, crossing lin-61, hpl-2 and met-2 mutants to mutants which HSN neurons fail to synthesize serotonin, or to mutants in which synaptic vesicles cannot be released, also results in a loss of 5-HT staining in VC4-5. Altogether, these experiments convincingly show that, in H3K9 methylation deficient mutants, VC4-5 reuptake serotonin from the nearby HSN neurons, in a mod-5/SERT dependent way. However, we could not detect mod-5 expression in VC4-5, despite using different kinds of reporters, including CRISPR-based knock-ins. 3.5 H3K9me is required cell-autonomously to repress 5-HT reuptake in C. elegans VC4-5 Components of the chromatin compaction machinery hpl-2, met-2 and lin-61 are broadly expressed and are rather pleiotropic. Therefore, we wanted to assess whether the effects observed in VC4 and VC5 in these mutants were due to cell autonomous or non cell autonomous action of these factors. Therefore, we performed rescue experiments of H3K9me deficient mutants with cell specific promoters. We overexpressed HPL-2 isoforms a and c, LIN-61 isoform a and MET-2 unique isoform specifically in VCs or HSNs (as a control) and performed immunostaining. We found that, in all cases, overexpression in VC4-5 reduced 5-HT staining to levels similar to wildtype worms, whereas overexpression in HSN had no effect. 3.6 VC4-5 critical period for becoming serotonergic in H3K9me deficient background is L4 In order to find out at what developmental point the action of H3K9me was required to restrain VC4 and VC5 5-HT fate in C. elegans we took advantage of the temperature sensitive phenotype of H3K9me mutants. VC4 and VC5 become 5-HT positive in hpl-2, lin-61 and met-2 mutants when worms are grown at 25ºC but not at 15ºC. Thus we performed a series of temperature shift experiments to determine the time window in which these factors are required. We kept synchronized populations of worms at 15ºC or 25ºC, and every 12h we shifted (up or down) a part of the population. Additionally, some worms were kept at 25ºC only for 24h. We found that, regardless of the total amount of time spent at 25ºC, only worms that had been at 25ºC through the L4 stage showed 5-HT VC4-5. These experiments show that H3K9me during L4, the stage in which VC neurons mature, is critical for the repression of 5-HT phenotype . 3.7 UNC-4 and HLH-3 are required for 5-HT staining in VC4 and VC5 in H3K9me deficient mutants According to the terminal selector conceptual framework, most cell-specific properties in a cell subtype are expected to be regulated by the same set of transcription factors. Since we already knew that UNC-4 and HLH-3 regulate cat-1 expression in VC4 and VC5, we assessed whether they were required for the 5-HT phenotype observed in heterochromatin formation deficient mutants. We crossed unc-4 and hlh-3 to lin-61 mutants. In both double mutants, VC4 and VC5 lost their 5-HT staining compared to lin-61 mutants alone. 3.8 HSN laser ablation abolish VC4-5 serotonin staining in C. angaria and C. elegans H3K9 chromatin mutants. In summary, our results so far indicate that: 1) VC4 and VC5 neurons in the C. angaria group have acquired the ability to stain for serotonin in a constitutive manner, 2) In C. elegans, VC4 and VC5 serotonergic staining is restrained by H3K9 methylation cell-autonomously. Without this histone mark, VC4 and VC5 reuptake 5- HT from the nearby HSN by the action of mod-5/SERT. Thus our next aim was to study if, as in C. elegans heterochromain mutants, the regulation of VC4 and VC5 serotonergic phenotype in C. angaria was dependent on 5-HT reuptake. Expression of C. angaria mod-5 reporter in C. elegans and C. angaria indicates so. Since no mutant strains are available in this species, we decided to use an alternative strategy to test for 5-HT. If C. angaria VC4-5 re-uptake 5-HT from the neighbouring HSN, then laser ablation of these cells should abolish VC4-5 5-HT staining. Therefore, we perfomed laser ablations of HSNs at L1 stage, long before they differentiate. First, as a positive control, HSNs were laser ablated in C. elegans lin-61 mutants and worms were stained upon reaching adulthood. In these worms, VC4-5 lost their 5-HT staining. Similarly, in HSN-ablated C. angaria females, VC4 and VC5 also lost their serotonin staining, indicating that VC4 and VC5 acquire their staining by reuptaking serotonin released by HSNs. 3.9. Functional relevance of the VC4-5 serotonergic phenotype Besides studying the molecular changes leading to VC4 and VC5 serotonergic phenotype in the angaria group, we were interested in understanding the functional implications of this evolutionary change. VC4 and VC5, together with HSN neurons, are central in controlling egg-laying behaviour. This behaviour has been modelled as a three-state process in which serotonin released by the HSN neurons acts on vm1 and vm2 muscle cells through CGPR as a facilitator of the egg-laying active state, in which egg-laying events are highly probable, and acetylcholine released by both HSN and VC neurons triggers individual egg-laying events. Additionally, it has been shown that VC4 and VC5 and uv1 neurosecretory cell inhibit HSNs, and HSNs activates VC4 and VC5. It has been shown that in a low osmolarity medium, both HSNs and VC4 and VC5 show a higher frequency of calcium spikes, and egg-laying rate increases, whereas HSN and VC activity, and subsequently egg-laying, are inhibited in high osmolarity media, such as M9. If exogenous serotonin is added to the medium, however, egg laying rate increases, which indicates that 5-HT signalling from HSN induces egg laying. We evaluated sensitivity to exogenous 5-HT in several Caenorhabditis species; we selected some species in the elegans group, such as C. briggsae, some species of the Drosophilae group (C. sp. 2 and C. virilis), which are close to C. angaria but do not belong to the angaria subgroup, and to not show serotonergic VCs, and all the angaria group species. We used a very standard test to evaluate egg laying behaviour. Briefly, synchronized worms are grown until the adult stage (they are about 24h adults when assayed), and they are incubated for 1 hour in individual wells with M9 or in M9 plus 35mM 5-HT hydrochloride, after which the egg number in each well is annotated. All the species without serotonergic VC4 and VC5 in the elegans or the Drosophilae groups showed an evident increase in the egg-laying rate upon treatment with exogenous 5-HT, with one exception. C. monodelphis does not have serotonergic HSN neurons, therefore, it is expected that vulval muscles are not responsive to serotonin. This seems to be the case. On the other hand, treatment with exogenous 5-HT in species within the angaria group had either no effect (C. angaria RGD1 strain and C. sp. 8) or an inhibitory effect (C. angaria PS1010 strain, C. castelli, C. quiockensis), with the exception of C. sp. 24, in which 5-HT treatment also seemed to produce an enhancement of egg-laying. However, this species is particular because it does not only have 5-HT positive VC1-6, but also some extra VC-like and tail neurons. Overall, the VC serotonergic phenotype seems to be linked to differences in the functionality of the egg-laying circuit. 4. Methodology and Results 2: Bioinformatics analysis of the cis-regulatory logic controlling HSN terminal differentiation In order to identify the TF combination controlling HSN terminal differentiation, we followed a candidate approach, selecting six transcription factors that had been described to have an egg-laying defective phenotype (egl) linked to serotonin staining defects: the POU domain TF unc-86, the Spalt-type Zn finger TF sem-4, the bHLH domain TF hlh-3 and the Insm-type Zn finger TF egl-46, the ETS transcription factor ast-1 and the GATA factor egl-18. Carla Lloret, a PhD student in the laboratory, characterized the expression of several effector genes in the respective mutant backgrounds for the 6 TF candidates. She found that all six TFs are required for correct terminal differentiation of HSN. Complementarily, Miren Maicas, a post-doctoral researcher in the laboratory, performed extensive cis regulatory analysis of three serotonin pathway genes, cat-1, tph-1 and bas-1. Through site directed mutagenesis, Miren showed that these six transcription factors bind directly to cis-regulatory modules (CRMs) controlling transcription of 5-HT pathway genes. The direct action of these 6 TFs indicates that they behave as a transcription factor collective to orchestrate HSN neuron differentiation. Based on our experimental data, our next aim was to analyze if the HSN TF collective is able to impose a regulatory signature in HSN expressed genes that can distinguish them from the rest of the genome. 4.1 The HSN signature is over-represented in HSN-expressed genes and can be used to predict gene expression in HSN neurons. Since 5-HT pathway genes promoters bear binding motifs for all or most of the HSN TF collective, we hypothesized that, if the TF collective regulates transcription of most HSN-specific genes, clustered binding sites for these TFs would be more likely to occur within promoters and intronic regions of HSN-expressed genes than in the rest of the genome. We performed a genome-wide search of the HSN regulatory signature, which we defined as the presence of at least one putative binding site for each of the six TFs, in a region spanning 700 bp or less. We found that HSN signature was more prevalent in genes known to be expressed in HSN. Moreover, taking into account conservation (presence of signature in other Caenorhabditis species) increased relative enrichment of HSN-expressed vs other genes. We wondered whether the HSN signature was enough to predict de novo expression in HSN. We selected promoter regions bearing the HSN signature of genes that had been reported to be expressed in neurons. But not in HSN. 37% of them were expressed in HSN, whereas none of 10 control regions (without signature) were expressed in HSN. Therefore, presence of HSN signature has some predictive power regarding expression in HSN. However, it is often not enough; maybe additional motifs, syntactic rules of motif arrangement, motif number or intrinsic DNA properties are also required for expression in HSN. 4.2 Deep homology between HSN and mouse raphe serotonergic neurons Once we had characterized the HSN TF collective and the prevalence of the HSN regulatory signature in the C. elegans genome, we aimed to assess whether the HSN regulatory logic was conserved in mammals. Indeed, we found that mouse orthologs for four out of the six TFs of the HSN collective were already known to be involved in mammalian serotonergic specification: bHLH TF ASCL1, GATA2/3, INSM1 and ETS TF PET1, which are orthologs of hlh-3, egl-18, egl-46 and ast-1, respectively. Additionally, Laura Chirivella at my laboratory studied the expression pattern of BRN2, a POU transcription factor ortholog to unc-86 which has been associated with serotonergic specification, and found that it is expressed in serotonergic neuron progenitors and postmitotic serotonergic neurons at embryonic stage E11.5, when serotonergic neurons are differentiating. She also studied the expression pattern of SALL2, the closest mouse ortholog of sem-4, and found that it is also expressed in serotonergic neuron progenitors and postmitotic serotonergic neurons at E11.5. We hypothesized that, given that HSN and mouse raphe 5-HT neurons specification seemed to be regulated by the same set of TFs, these two neuron types might share broad molecular similarities and not only the serotonin pathway genes. To test this hypothesis, we integrated the Hobert neuronal atlas with published RNA-seq data of the mouse raphe 5-HT neurons and performed hierarchical clustering on the resulting cell type-gene expression matrix. Interestingly, HSN neuron expression profile clustered with the raphe serotonergic nuclei with high bootstrap support. Considering the similarities between HSN and mouse raphe regarding transcriptome and TF collective we next aimed to analyze whether a similar 5-HT regulatory signature is present in the mouse genome. We found that mouse genomic regions predicted by the ENCODE consortium to act as enhancers in hindbrain, which is where 5-HT neuron populations are found, are enriched in serotonergic regulatory signature with respect to predicted enhancers from other non serotonergic tissues (p<0.05, Tukey’s HSD test after logistic regression). We conclude that, from all C. elegans neurons, the HSN partial transcriptome is molecularly the closest to the mouse raphe serotonergic neurons transcriptome, and that active hindbrain enhancers are enriched in the serotonergic signature compared to enhancers active in other tissues. Therefore, and taking into account also the experimental evidence summarized above, HSN neurons and mouse raphe 5-HT neurons share deep homology. 5. Conclusions Serotonergic identity of VC4 and VC5 evolved once within the Caenorhabditis genus, in the lineage that gave rise to the angaria group, comprised by C. angaria, C. castelli, C. quiockensis, C. sp. 8 and C. sp. 24. C. angaria mod-5/SERT promoter is able to drive reporter expression in both C. elegans and C. angaria VC4 and VC5. Therefore, VC4 and VC5, in C. angaria, most likely reuptake serotonin, rather than synthesize i.t Changes in mod-5/SERT promoter are responsible for changes in mod-5 expression between C. angaria and C. elegans. UNC-4 paired-like homeodomain and HLH-3 bHLH TFs regulate cat-1 reporter expression in VC4 and VC5. C. elegans mutants for hpl-2, met-2 and lin-61, but not set-25, have an increased percentage of 5-HT positive VC4 and VC5, which is also due to 5-HT reuptake. The requirement of these genes for 5-HT phenotype repression is cell-autonomous. Since C. elegans H3K9me deficient mutants have a VC4 and VC5 phenotype similar to that of C. angaria, changes in C. angaria mod-5 promoter could be related to changes in recruitment of chromatin factors, rather than exclusively in TFBS. The joint presence of predicted binding sites for the six TFs of the TF collective regulating HSN differentiation (HSN signature) is more prevalent in genes known to be expressed in HSN than in the rest of the genome. Conservation in Caenorhabditis species increases enrichment in HSN-expressed genes versus the rest of the genome. Additionally, presence of the HSN signature can be used to predict reporter expression in HSN. The HSN neuron shows molecular homology with mouse raphe serotonergic neurons, but not with other mouse neuronal populations. Accordingly, the mouse orthologous of the HSN signature is slightly more prevalent in ENCODE annotated enhancers of the mouse midbrain than in enhancers active in other body regions.