Bacillus thuringiensis és un bacteri que pertany al grup de Bacillus cereus i produeix una gran varietat de proteïnes insecticides juntament amb altres factors de virulència que contribueixen a la seva patogenicitat. Bacillus thuringiensis s'ha considerat com el agent bioinsecticida amb més èxit durant el segle passat. Actualment, és àmpliament utilitzat com agent microbià per a les principals plagues d'insectes com a formulat (selecció de aïllats de B. thuringiensis escollits per la seua combinació de proteïnes insecticides present en el cristall parasporal) o mitjançant l’expressió de les proteïnes insecticides (cultius Bt) en plantes d’interès agronòmic (dacsa, cotó, soja, etc.). En quant al seu cicle de vida, B. thuringiensis és un bacteri gram-positiu, anaeròbic facultatiu, quimioorganotròfic i amb una distribució cosmopolita. El tret característic de B. thuringiensis es la formació de inclusions cristal·lines (proteïnes Cry) que son tòxiques contra insectes, especialment contra plagues que produeixen grans danys en diversos cultius. El mecanisme general de toxicitat de B. thuringiensis consisteix en un primer pas en la ingesta de les proteïnes insecticides i solubilització al tracte intestinal. Després de la solubilització, les proteïnes (protoxines) son activades per les proteases intestinals a la seua forma activa (toxines). Les toxines travessen la membrana peritrófica, s’uneixen als receptors específics de la vora en raspall en la membrana apical del intestí d’insectes susceptibles. Seguit de la unió de la proteïna al receptors específics, aquesta s’insereix, de manera immediata e irreversible, en la membrana cel·lular formant porus que provoquen la lisis cel·lular. La lisis massiva de moltes cèl·lules del intestí provoca la disrupció del intestí i la mort del insecte per septicèmia. A mes a més, B. thuringiensis també produeix altres factors de virulència que faciliten l’acció de les proteïnes insecticides com son: proteases (destrueixen el pèptids antimicrobians generats per part del insecte com a resposta a la intoxicació amb B. thuringiensis), bacteriocines i pèptids antibacterians (competeixen amb la microbiota resident al intestí del insecte), quitinases i “enhancins” (desintegren la membrana peritrófica). En la present tesi doctoral, s’ha realitzat la detecció de nous gens de proteïnes insecticides de B. thuringiensis a partir d'un conjunt d’aïllats de B. thuringiensis seleccionats basat en el seu contingut genètic. També vam estudiar detalladament diferents aspectes (espectre insecticida, resistència creuada, mode d'acció i resposta de mort cel·lular de Spodoptera exigua intoxicada amb la proteïna Vip3Ca) de la nova família de proteïnes Vip3Ca. La recerca de nous gens de proteïnes insecticides amb un espectre insecticida i mode d’acció diferent al descrit per a les diferents toxines B. thuringiensis es una aproximació utilitzada per incrementar l’espectre insecticida de les toxines de B. thuringiensis i retardar l’aparició de poblacions d’insectes resistents. Un mètode utilitzat per a la recerca de nous gens de proteïnes insecticides es el cribat de col·leccions de aïllats de B. thuringiensis de diferents localitzacions i hàbitats mitjançant la utilització de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) o, recentment, mitjançant tecnologies d’alt rendiment com son: la seqüenciació massiva de DNA genòmic de bacteris i la identificació de proteïnes mitjançant de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de masses. Pel que fa a la recerca de nous gens de proteïnes insecticides, vam partir d'un conjunt d’aïllats de B. thuringiensis possibles portadors de nous gens vip1 i vip2. En un primer pas, vàrem realitzar dues PCR on, en la primera d’aquestes, determinàvem la presència de gens vip1 i vip2, mentre que, en la segona PCR, caracteritzàvem a quin del gens vip1 i vip2 descrits eren més semblants les seqüencies obtingudes. Com a resultat obtinguérem la presència de dos nous al·lels de les parelles de gens vip2Ac1 - vip1Ca1 i vip2Bb1 - vip1Bb1 als aïllats B. thuringiensis V-J20.2, V-LE1.1, V-V54.26, V-V54.31, E-TE7.43, E-TE16.5 i E-TE18.40. També es detectaren la presència de dos seqüencies amb baix percentatge d’identitat als gens vip1Bb1 i vip1Da1 als aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2. En un segon pas, per tal de determinar la seqüencia completa dels gens amb baix percentatge d’identitat a vip1Bb1 i vip1Da, es va realitzar la seqüenciació massiva de DNA genòmic de ambdós bacteris mitjançant la plataforma de seqüenciació Illumina HiSeq-PE150. A partir de les lectures netes, subministrades per Novogene S.L., varen ser ensamblades, anotades, i les seqüències codificants foren predites abans de realitzar una recerca per homologia contra una base de dades específica de toxines de B. thuringiensis, i posteriorment es va validar el resultat obtingut amb la recerca per homologia contra la base de dades “Non-Redundant database” del NCBI. Com a resultat obtinguérem la predicció de 24 gens de proteïnes insecticides entre els aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2. Per tal de determinar quants dels gens insecticides predits son expressats pels aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2, es va buscar la seua presència al sobrenedant i en la mescla d’espores i cristalls per medi de la identificació de proteïnes amb cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses. Com a resultat, trobàrem una nova parella de proteïnes tipus Vip (Vip2Ac-like_1-Vip4Aa-like_1), dues noves proteïnes tipus Vip (Vip2Ac-like_1 i Vip4Aa-like_2), una proteïna semblant a Sip1A (Sip1A-like_1) i vuit proteïnes tipus Cry (Cry23Aa-like, Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32Da-like, Cry32Eb-like i Cry73Aa-like). Una vegada determinada el nombre de noves proteïnes insecticides que són produïdes pels aïllats de B. thuringiensis E-10.2 i O-V84.2, es va procedir a determinar la seua localització subcel·lular i en quina quantitat eren produïdes per B. thuringiensis. Per tal de determinar la localització subcel·lular de les proteïnes tipus Vip i Cry es van detectar les proteïnes presents en el sobrenedant (24h i 48h) i en la mescla d’espores i cristalls per separat, en tres rèpliques independents. El resultat obtingut fou que les proteïnes tipus Vip es van detectar en els sobrenedants, mentre que les proteïnes tipus Cry es van trobar en el cristall parasporal, excepte per la proteïna Cry23Aa-like que també es troba en el sobrenedant del aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2 al temps 24 h i 48 h. Pel que respecta a la quantificació de les proteïnes tipus Vip i Cry en tres rèpliques independents, es van utilitzar dues aproximacions diferents: (I) Determinar l’abundància relativa de les proteïnes tipus Vip i Cry en la mateixa rèplica a un temps fixe, i (II) anàlisi lliure de marca dels sobrenedants a 24 h i 48 h dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 per comparar la quantitat de les proteïnes a dos temps concrets. Pel que fa als resultats obtinguts de la abundància relativa, indiquen que les proteïnes tipus Vip s’expressen de manera marginal al sobrenedant a 24 h i 48 h en els aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2. A més a més, en el cas de l’aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2, la proteïna Cry23Aa-like fou la proteïna més abundant del sobrenedant a 24 h i 48 h, indicant que el cultiu es trobaria en l’inici de la fase d’esporulació. Per a les proteïnes Cry, es van detectar en la mescla d’espores i cristalls, on l’aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2 expressa únicament la proteïna Cry23Aa-like, amb un percentatge en pes entre el 2.5% - 30%, mentre que l’aïllat de B. thuringiensis O-V84.2 expressa set proteïnes diferents amb els següents percentatges en pes: 1.4% - 2.8% Cry45Aa-like_1, 2.0% - 3.3% Cry45Aa-like_1, 1.8% - 5.3% Cry45Aa-like_3, 24.3% - 25.9% Cry32Ea-like, 4.6% - 6.1% Cry32Da-like, 4.4% - 6.2% Cry32Eb-like i 2.8% - 4.2% Cry73Aa-like. En quant als resultats obtinguts de l’anàlisi lliure de marca dels sobrenedants dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 a 24 h i 48 h, indiquen que les proteïnes insecticides Vip4Aa-like_1 i Vip4Aa-like_2 de l’aïllat de B. thuringiensis O-V84.2 mostren diferències significatives entre les 24 h i 48 h. La proteïna Vip4Aa-like_1 es troba incrementada en la seua quantitat dues vegades a 48 h respecte a les 24 h, mentre que la proteïna Vip4Aa-like_2 es va detectar a 24 h però no es detecta a 48 h. Pel que respecta a la resta de proteïnes tipus Vip, es varen trobar al sobrenedant i no mostraren diferències significatives en la seua producció entre les 24 h i 48 h. Per finalitzar aquest estudi, es va comprovar la toxicitat de les proteïnes tipus Vip i Cry expressades pels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 and O-V84.2, mitjançant la realització de bioassajos amb neonats de les espècies d’insectes plaga Spodoptera exigua i Spodoptera littoralis utilitzant el sobrenedant concentrat dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 and O-V84.2 (autoclavats i no autoclavats) i les proteïnes solubilitzades de la mescla d’espores i cristalls. El resultat dels bioassajos amb les proteïnes solubilitzades de la mescla d’espores i cristalls de l’aïllat de B. thuringiensis E-SE10.2 indica que la proteïna Cry23Aa-like mostra certa toxicitat a S. exigua i S. littoralis, mentre que no s’observa cap efecte en les proteïnes solubilitzades de la mescla d’espores i cristalls de l’aïllat de B. thuringiensis O-V84.2. En quant a les proteïnes tipus Vip, el sobrenedant concentrat, autoclavat i no autoclavat, dels aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 no mostraren toxicitat front a cap de les dues espècies d’ insectes provades. Les proteïnes Vip3 son proteïnes insecticides produïdes per B. thuringiensis durant la fase vegetativa i secretades al medi extracel·lular. En el moment d’escriptura d’aquesta tesi, les proteïnes Vip3 es troben agrupades en tres famílies proteiques: Vip3A, Vip3B i Vip3C. Les proteïnes Vip3A son les més abundants i, per tant, amb les que s’ha dut a terme la majoria dels estudis publicats i sobre les que més informació es troba disponible sobre el seu espectre insecticida i mode de acció. Pel que respecta a les proteïnes Vip3B i Vip3C, són menys abundants i pocs estudis s’han realitzat amb aquestes proteïnes. La proteïna Vip3A té una mida al voltant de ~85-90 kDa quant és secretada al medi, mentre que al ser activada per les proteases intestinals genera dos fragments, un de 20 kDa (N-terminal) i l’altre de 60 kDa (C-terminal). La toxina activada mostra toxicitat contra un ampli rang d’espècies de lepidòpters, amb alguns d’aquests que fins i tot mostren una baixa susceptibilitat a les proteïnes Cry, com ara pot ser Agrotis ipsilon, S. exigua i Spodoptera frugiperda. Pel que respecta al mode d’acció de les proteïnes Vip3, principalment Vip3Aa, aquest segueix la mateixa seqüencia d’esdeveniments descrits per a les proteïnes Cry: (I) Ingesta de les proteïnes Vip3A per l’insecte, (II) activació de la proteïna Vip3A per part de les proteases intestinals i migració a través de la membrana peritròfica, (III) unió de la proteïna Vip3A activada al receptors específics de membrana de la vora en raspall de les cèl·lules intestinals, i (IV) formació del porus i lisi cel·lular. Pel que respecta a la informació disponible sobre la Vip3Ca, prèvia a la realització de la present tesi doctoral, fou un treball conjunt del grup d’investigació “Control Biotecnològic de Plagues”, de la Universitat de València, i el grup d’investigació “Protección de Cultivos”, de la “Universidad Pública de Navarra”. En aquest treball, publicat en una nota curta, es descriu per primera vegada la proteïna Vip3Ca i demostren que és moderadament tòxica contra Mamestra brassicae, Trichoplusi ni i Crysodeixis chalcites. Donat que ja teníem informació prèvia sobre l’espectre insecticida de la proteïna Vip3Ca, en un primer pas vam ampliar l’estudi sobre el seu espectre insecticida en deu espècies més de lepidòpters plaga (Cydia pomonella, Grapholita molesta, Sesamia nonagrioides, Galleria mellonella, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Ephestia kuehniella, Plodia interpunctella i Ostrinia furnacalis), una espècie d’àfid (Nezara viridula) i un organisme model (Drosophila melanogaster). Es van utilitzar diverses metodologies de bioassaig. Per a les espècies que es va provar la proteïna per contaminació superficial, C. pomonella va ser la més susceptible, seguida de G. mellonella, amb percentatges de mortalitat superiors al 50%. Pel que fa a les quatre espècies on la proteïna es va provar incorporada en la dieta, O. furnacalis va ser la més susceptible, amb un valor LC50 de 0.31 μg/g. Pel que respecta a la resta dels bioassaigs, Tuta absoluta va mostrar certa susceptibilitat a altes concentracions de Vip3Ca (30% de mortalitat). En un segon pas, avaluàrem la proteïna Vip3Ca en colònies d’insectes resistents a les proteïnes Cry1A, Cry2A iVip3. Pel que respecta a la proteïna Vip3A, es troba descrit que les colònies d’insectes resistents a les proteïnes Cry1A o Cry2A no mostren resistència creuada a la Vip3A i vice versa. Per tal de dur a terme aquest objectiu, es varen provar diferents colònies d'insectes resistents a les proteïnes Cry1A (H. armigera, T. ni, O. furnacalis i P. interpunctella), Cry2A (H. armigera i T. ni) i Vip3 i Vip3/Cry2Ab (H. armigera) per a la seua susceptibilitat front a la proteïna Vip3Ca, per determinar si presentaven resistència creuada. Els resultats van mostrar que les colònies d'insectes resistents a Cry1A (H. armigera, T. ni, O. furnacalis i P. interpunctella) o Cry2Ab (H. armigera i T. ni) no mostraren resistència creuada a les proteïnes Vip3 (Vip3Aa i Vip3Ca). Per contra, les colònies de H. armigera resistents a les proteïnes Vip3Aa o Vip3Aa/Cry2Ab van mostrar resistència creuada a la proteïna Vip3Ca. Hem de mencionar que, com un treball secundari sorgit a partir de la recerca d’espècies susceptibles, fou l’estudi monogràfic sobre la susceptibilitat de G. molesta als formulats de B. thuringiensis, les seues toxines i sinergies entre les proteïnes Cry i Vip3. Com a resultat obtinguérem que G. molesta és altament susceptible al formulats de B. thuringiensis, Dipel® i Xentari®, i a les toxines de B. thuringiensis Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1C, Vip3Aa i Vip3Af. Una vegada determinat que G. molesta és susceptible a les toxines Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1C i Vip3Aa, es va determinar les possibles sinergies entre aquestes proteïnes. Les combinacions de proteïnes Cry1Aa-Vip3Aa i Cry1C-Vip3Aa foren antagòniques mentre que la combinació de proteïnes Cry1Ac-Vip3Aa va mostrar un efecte additiu. És interesant mencionar que el antagonisme detectat en les combinacions de proteïnes Cry1Aa-Vip3Aa i Cry1C-Vip3Aa augmentava segons era major la quantitat de proteïna Vip3A en la mescla; aquest fet suggereix que encara que aquestes no competeixen llocs d’unió potser interactuen en esdeveniments anteriors a la unió fent més o menys accessible la unió al receptor. Per aprofundir en el mode d'acció de la proteïna Vip3Ca i comprovar si és similar al descrit per a la proteïna Vip3A, escollirem M. brassicae degut a la seua relativament alta susceptibilitat a la proteïna Vip3C i Vip3A. Els experiments duts a terme per estudiar el mode d’acció de la proteïna Vip3Ca foren els següents: (I) Proteòlisi i oligomerització de la proteïna Vip3Ca, (II) efectes histopatològics i unió in vivo / in vitro de Vip3Ca, i (III) resposta de la mort cel·lular de S. exigua intoxicada amb Vip3Ca2. (I) Proteòlisi i oligomerització de la proteïna Vip3Ca. En un primer pas volguérem demostrar si la proteïna Vip3Ca mostrava un patró d’activació similar a la proteïna Vip3Aa. S’ha descrit que, per a la proteïna Vip3A, l’activació amb proteases (tripsina o suc intestinal) genera dos fragments de 20 kDa i 60 kDa. Pel que respecta a la proteïna Vip3Ca, primer es va determinar el seu patró proteolític amb tripsina i suc intestinal, mostrant que la proteïna Vip3Ca es processava a dos fragments majoritaris de ~ 70 kDa i ~ 20 kDa, tant si utilitzàvem tripsina com suc intestinal. Hem de fer notar que pel que respecta a la cinètica d’activació de la proteïna Vip3Ca amb el suc intestinal d'espècies d'insectes que mostren diferent susceptibilitat, es correlacionava amb la susceptibilitat d’aquestes espècies d'insectes a la proteïna Vip3Ca. Donat que la cinètica d’activació de la proteïna Vip3Ca amb el suc intestinal de diferents espècies d'insectes es correlaciona amb la susceptibilitat d’aquestes per a la Vip3Ca, volguérem determinar si això es devia a una incorrecta activació de la proteïna. En el cas de la Vip3Aa s’ha demostrat que la diferent susceptibilitat mostrada per part de les diferents espècies d’insectes no es deu a una inapropiada activació de la proteïna. En quant a la proteïna Vip3Ca, per descartar que les diferències en la toxicitat de la proteïna Vip3Ca es devien a una activació inapropiada de la proteïna, la proteïna Vip3Ca es va processar amb suc intestinal de O. nubilalis o M. Brassicae i això no va modificar significativament la seva toxicitat a cap espècie d'insecte. Per finalitzar aquest punt volguérem demostrar si la proteïna Vip3Ca forma oligòmers (tetràmers) com ja s’ha demostrar per a la proteïna Vip3Aa. Per determinar si la proteïna Vip3Ca forma oligòmers, la mida de la Vip3Ca digerida amb tripsina i suc intestinal de M. brassicae es va determinar per cromatografia d’exclusió molecular. Com a resultat, vam trobar que la proteïna Vip3Ca activada, tant amb tripsina com amb suc intestinal, forma un oligòmer de 4 unitats que és estable fins a dos dies en solució. A més, els fragments de la toxina de ~ 70 kDa i ~ 20 kDa elueixen junts, el que suggereix que ambdós fragments de proteïnes són necessaris per formar l'oligòmer, com ja s’ha demostrat per a la proteïna Vip3Aa. (II) Efectes histopatològics i unió in vivo / in vitro de Vip3Ca. En un primer pas volguérem demostrar si la proteïna Vip3Ca és capaç de causar danys en l’intestí d’espècies d’insectes susceptibles i si s’uneix la proteïna de manera específica a receptors de membrana i competeix pels mateixos llocs d’unió que la Vip3Aa. Els efectes histopatològics de la proteïna Vip3Ca es van determinar en talls histològics de l’intestí de M .brassicae intoxicat a diferents temps amb la proteïna Vip3Ca. Els resultats van indicar que la proteïna Vip3Ca pot causar grans danys en l'epiteli intestinal de M. brassicae, però quan es va comparar amb la Vip3Aa (control positiu de toxicitat), es va veure que la proteïna Vip3Ca necessita més temps per a mostrar els mateixos efectes histopatològics que la proteïna Vip3Aa. Per determinar si els danys observat a l’epiteli intestinal de M. brassicae es devien a la unió de la proteïna Vip3Ca a les cèl·lules de l’epiteli intestinal, les larves de M .brassicae es van alimentar amb Vip3Ca durant 3 h. El resultat va ser que la Vip3Ca s’unia a l’epiteli de M. brassicae, observat mitjançant tècniques immunofluorecents. Amb l'objectiu de demostrar que la unió observada de la proteïna Vip3Ca a l’epiteli intestinal de M. brassicae és específica i que la proteïna Vip3Ca competeix pels mateixos llocs d'unió que la proteïna Vip3Aa, es van realitzar assaigs d’unió amb les proteïnes Vip3 marcades amb biotina. La competència homòloga va mostrar que les proteïnes Vip3Aa i Vip3Ca s’uneixen de manera específica a les vesícules de membrana de vora en raspall (BBMV) perquè les respectives proteïnes Vip3 no marcades poden desplaçar les proteïnes homòlogues. Els experiment de competència heteròloga van indicar que Vip3Ca i Vip3Aa comparteixen llocs d'unió indicant per primera vegada que diferents famílies de proteïnes Vip3 competeixen pels mateixos llocs d’unió. El fet que les proteïnes Vip3Aa i Vip3Ca competeixen pels mateixos llocs d’unió té importants implicacions en la gestió del control de plagues. La combinació de les proteïnes Vip3Aa i Vip3Ca no seria optima per al control d’espècies d’insectes plaga, perquè l’aparició de resistència a la Vip3Aa (per modificació del receptor) provocaria al mateix temps la presencia de resistència creuada cap a la Vip3Ca. (III) Resposta de la mort cel·lular de S. exigua intoxicada amb Vip3Ca2. L'elecció de S. exigua es va deure al fet que publicacions anteriors descrivien un conjunt de 47 gens en S. exigua que responien a la intoxicació de la proteïna Vip3A. L'anàlisi d'expressió gènica dels 47 gens candidats indica que el nombre de gens de S. exigua que responen és dependent de la dosi, on el nombre màxim de gens que responien es trobaren a la dosi de 10.000 ng/cm2. En quant als gens sobre-expressats a les diferents dosis provades, els resultats indiquen que es troben implicats en el sistema immune i la modulació hormonal, mentre que els gens reprimits participen en el procés de digestió i la permeabilitat a la membrana . A més, el gen que codifica un component de la ruta Jak-Stat es va trobar reprimit després de 24 hores d'exposició a la dosi més alta provada. Pel que respecta a l’efecte de les proteïnes Vip3Ca i Vip3Aa a les dosis utilitzades en l’epiteli intestinal, els resultats indiquen que la presència de dany (medit com l'alliberament d'aminopeptidasa N) és major quan les larves són exposades a la proteïna Vip3Aa més que quan són exposades a concentracions que produeixen una inhibició del creixement > 99% de la proteïna Vip3Ca. Hem de fer notar que també es mesura el cost biològic associat a la intoxicació amb les proteïna Vip3Ca i Vip3Aa on les larves de S. exigua mostraren un augment en el temps de pupació i una reducció del percentatge de pupació. Per determinar si la repressió de la via Jak-Stat està implicada en l'apoptosi, es va mesurar el nivell d'expressió de les caspases de S. exigua (Se-caspasa-1, Se-caspasa-2, Se-caspasa-3, Se-caspasa-4, Se-caspasa-5 i Se-caspasa-6) i es realitzaren talls histològics de l’intestí de S. exigua que es tenyiren amb la tècnica del TUNEL. Els resultats obtinguts indicaren que Se-caspasa-4 estava sobre-expressada en tots els intervals temporals (3h, 6h, 12h i 24h) mentre que la Se-caspasa-1 i Se-caspase-2 sols estaven sobre-expressades a les 12 h. En quant als resultats obtinguts en els talls histològics tenyits per la tècnica del TUNEL, mostraren la presència de cèl·lules positives per a la Vip3Ca a la dosi de 10.000 ng/cm2 mentre que per a la Vip3Aa es detectaren presència de cèl·lules positives per a les dosis entre 1-100 ng/cm2 però no a la màxima dosi, degut a que el dany fou tan gran que probablement participen altres vies de mort cel·lular que no involucren l’apoptosi. En resum, en la present tesi doctoral hem detectat la presència d’una sèrie de nous gens tipus Vip i Cry a partir de dos aïllats de B. thuringiensis i, per primera vegada, hem aprofundit en el mode d’acció de la proteïna Vip3Ca. El resultats obtinguts sobre l’espectre insecticida de la proteïna i el mode d’acció de la proteïna Vip3Ca suposen una gran font d’informació sobre el comportament d’aquesta proteïna tant poc estudiada fins al moment de la realització de la present tesi doctoral. Pel que respecta a les conclusions específiques obtingudes a partir del treball realitzat, durant les ultimes cinc anualitats, han sigut les següents: 1.- En els aïllats de B. thuringiensis E-SE10.2 i O-V84.2 es van identificar 13 proteïnes insecticides noves a partir de dos aïllaments seleccionats pel seu contingut gènic. Les proteïnes tipus Vip i Sip (Vip2Ac-like_1-Vip4Aa-like_1, Vip2Ac-like_1, Vip4Aa-like_2 i Sip1A-like_1) s’expressaven de manera marginal en el sobrenedant mentre que les proteïnes tipus Cry (Cry23Aa-like, Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32Da-like, Cry32Eb-like i Cry73Aa-like) es localitzaven en el cristall parasporal. 2.- L'estudi de l’espectre insecticida de la proteïna Vip3Ca es va ampliar a 12 noves espècies d'insectes, on O. furnacalis fou la més susceptible. Pel que fa a l'anàlisi de la resistència creuada a les plagues de lepidòpters, indiquen que la resistència deguda a la selecció amb proteïnes Cry no confereix resistència creuada a Vip3Ca, mentre que les poblacions d'insectes resistents a Vip3A mostren resistència creuada a la proteïna Vip3Ca. 3.- Grapholita molesta és altament susceptible als formulats de B. thuringiensis i les seves toxines individuals (Cry i Vip3). Pel que fa a les interaccions entre les proteïnes Cry i Vip3, es va trobar l'antagonisme en les combinacions Cry1Aa-Vip3Aa i Cry1C-Vip3Aa. 4.- La proteïna Vip3Ca es processa en dos fragments de ~ 70 kDa i ~ 20 kDa, tant utilitzant tripsina com suc intestinal. La proteïna Vip3Ca activada amb tripsina i suc de midgut de M. brassicae forma un oligòmer de 4 subunitats. La proteïna Vip3Ca és capaç d'unir-se a l'epiteli produint la lisi cel·lular. A més, els assaigs d'unió van mostrar que Vip3Ca s’uneix específicament i competeix pels mateixos llocs d'unió que la proteïna Vip3Aa. 5.- L'exposició de les larves de S. exigua a les concentracions subletals de la proteïna Vip3Ca activa diferents vies de resposta d'insectes que desencadenen la regulació d'alguns gens pertanyents al grup de resposta a patògens, indueixen l’alliberament d'APN i desencadena l’activació de la via depenent de caspasa que indueix la resposta apoptòtica.

Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacterium that belongs to the Bacillus cereus group and produces a wide variety of insecticidal proteins along with other virulence factors contributing to its pathogenicity. Bacillus thuringiensis has been considered as the most successful bioinsecticidal agent during the last century. Currently, it is widely used as a microbial agent of the major insect pests. In the present doctoral thesis, we performed the screening for new B. thuringiensis insecticidal protein genes from selected B. thuringiensis isolates based on their gene content. Also, we studied in detail different aspects (insecticidal spectrum, cross-resistance, mode of action and cell death response of Spodoptera exigua intoxicated with the Vip3Ca protein) of the new Vip3Ca protein family. Regarding the mining of new insecticidal proteins, we found one new couple of binary Vip-like proteins (Vip2Ac-like_1-Vip4Aa-like_1), two new Vip-like proteins (Vip2Ac-like_1 and Vip4Aa-like_2); one Sip1A-like protein (Sip1A-like_1) and eight Crystal-like proteins (Cry23A-like, Cry45Aa-like_1, Cry45Aa-like_2, Cry45Aa-like_3, Cry32Ea-like, Cry32Da-like, Cry32Eb-like and Cry73Aa-like). The Vip-like proteins have been detected in the supernatant, marginally expressed, while the Crystal-like proteins have been found in the parasporal crystal (E-SE10.2: 2.5 % - 30 % ; O-V84.2: 7.0 % - 9.8 % Cry45-like proteins, 30.4 % - 30.5 % Cry32-like proteins and 2.8 % - 4.25 % Cry73Aa-like), except the Cry23Aa-like protein, that has also been found in the supernatant at 24 h and 48 h. In addition, the toxicity of the supernatant (E-SE10.2: 24 h and 48 h; O-V84.2: 24 h and 48 h) and parasporal crystal (E-SE10.2 and O-V84.2) has been tested in S. exigua and Spodoptera littoralis, where the Cry23Aa-like showed some toxicity to both insect species. In the case of the Vip3Ca protein, we first extended the study of its insecticidal activity to ten lepidopteran pests (Cydia pomonella, Grapholita molesta, Sesamia nonagrioides, Galleria mellonella, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Ephestia kuehniella, Plodia interpunctella and Ostrinia furnacalis), one aphid (Nezara viridula) and one model organism (Drosophila melanogaster). Several methodologies of biossays were used. For the species tested by surface contamination, C. pomonella was the most susceptible one, followed by G. mellonella, with percentages of mortality higher than 50%. Regarding the four species tested by diet incorporation, O. furnacalis was the most susceptible one, with an LC50 value of 0.31 µg/g. For the other types of bioassays, Tuta absoluta showed some susceptibility to high concentrations of Vip3Ca (30 % mortality). Also, several Cry1A, Cry2A, Dipel, Vip3 and Vip3/Cry2Ab resistant insect colonies were tested against the Vip3Ca protein to determine if they presented cross-resistance. The results showed that the insect colonies resistant to Cry1Ac (Helicoverpa armigera, Trichoplusia ni, O. furnacalis and P. interpunctella) or Cry2Ab (H. armigera and T. ni) were not cross-resistant to Vip3 proteins (Vip3Aa and Vip3Ca). In contrast, the H. armigera colonies resistant to Vip3Aa or Vip3Aa/Cry2Ab showed cross-resistance to the Vip3Ca protein. We should mention that, as a secondary work arising from the search for susceptible species, arose the monographic study on the susceptibility of G. molesta to those formulated by B. thuringiensis, its toxins (Cry and Vip3) and synergies between the Cry and Vip3 proteins. As a result, we found that G. molesta is highly susceptible to B. thuringiensis, Dipel® and Xentari® formulates, and to the B. thuringiensis toxins Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1C, Vip3Aa and Vip3Af. Once determined that G. molesta is susceptible to Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1C and Vip3Aa toxins, the possible synergies between these proteins were evaluated in dose-response assays. The combinations of Cry1Aa-Vip3Aa and Cry1C-Vip3Aa proteins were antagonistic while the combination of Cry1Ac-Vip3Aa proteins shows an additive effect. It is interesting to mention that the antagonism detected in the Cry1Aa-Vip3Aa and Cry1C-Vip3Aa protein combinations increased as the amount of Vip3A protein in the mixture was higher; this fact suggests that, though these proteins do not compete for the same binding sites, they may interact in events prior to the binding, making more or less accessible the binding to the receptor. To study in more detail the mode of action of the Vip3Ca protein, we chose M. brassicae because of its relatively high susceptibility to this toxin. (I) Proteolysis of the Vip3Ca protein and oligomerization The proteolytic pattern of the Vip3Ca protein with trypsin and midgut juice showed that theVip3Ca protein was processed into two main fragments of ~70 kDa and ~20 kDa. The kinetics of Vip3Ca with the midgut juice from insect species with different susceptibility correlated with the susceptibility of the insect species to this toxin. To discard that the differences in the toxicity of the Vip3Ca protein was due to inappropriate activation of the protein, the Vip3Ca protein was processed with midgut juice of O. nubilalis or M. brassicae and this did not significantly change its toxicity to either insect species. In an attempt to determine if the Vip3Ca protein makes oligomers, the size of the Vip3Ca digested with trypsin and midgut juice of M. brassicae was determined by size exclusion chromatography. As a result, we found that the Vip3Ca protein, either activated with trypsin or midgut juice, forms an oligomer composed of 4 units, that is stable up to two days in solution. Also, the toxin fragments of ~70 kDa and ~20 kDa coeluted together, suggesting that both protein bands are needed to form the oligomer. (II) Histopathological effects and in vivo / in vitro binding of Vip3Ca The histopathological effects of Vip3Ca were determined in midgut sections of M. brassicae intoxicated for different intervals with the Vip3Ca protein. The results indicated that the Vip3Ca protein was able to disrupt the midgut epithelium of M. brassicae. To know if the Vip3Ca protein binds to the midgut apical membrane, the larvae were fed with Vip3Ca and, after 3 h of exposure, the binding of the Vip3Ca protein to the midgut epithelium was detected. With the aim to demonstrate that the Vip3Ca protein bound specifically to the midgut epithelium of M. brassicae and compete for the same binding sites than Vip3Aa, binding assays were performed with biotin-labelled Vip3 proteins. The homologous competition showed that the Vip3Aa and Vip3Ca proteins bound specifically to the brush border membrane vesicles (BBMV) because the respective unlabelled Vip3 proteins were able to displace the homolog proteins. The heterologous competition experiments indicated that Vip3Ca and Vip3Aa share binding sites. (III) Cell death response of S. exigua intoxicated with Vip3Ca2 The election of S. exigua was due to the fact that a previous publication described a set of 47 S. exigua genes that responded to the intoxication by the Vip3A protein. The gene expression analysis indicated that the number of the S. exigua genes is dose-dependent. Regarding the up-regulated genes, these were involved in the immune system and hormone modulation, whereas the down-regulated genes were those involved in the digestion process and peritrophic membrane permeability. In addition, the gene encoding a component of the Jak-Stat pathway was found down-regulated after 24 h of exposure at the higher dose tested. The effect of the Vip3Aa and Vip3Ca proteins on the midgut epithelium indicated that the release of aminopeptidase N (APN) is higher when the larvae are exposed to Vip3Aa rather than Vip3Ca, at concentrations that produce growth inhibition > 99 %. Also, the fitness cost associated to the intoxication with the Vip3Ca and Vip3Aa protein is affected by an increase in the time of pupation and a reduction of the percentage of pupation. To determine if the down-regulation of the Jak-Stat pathway is involved in the apoptosis, the expression level of the caspases and TUNEL staining of midgut sections was performed. The results showed the presence of TUNEL-positive cells in the S. exigua midgut sections exposed to sublethal concentrations of Vip3Ca protein and the Se-caspase-4 was up-regulated at all the time intervals, while the Se-caspase-1 and Se-caspase-2 were up-regulated at 12 h.