L'agricultura contemporània exigeix cada cop més un ús sostenible d’agroquímics per tal de reduir l'impacte ambiental i el risc per la salut del consumidor. Alguns bacteris entomopatògens produeixen proteïnes insecticides que s'acumulen en cossos d'inclusió o cristalls paraesporales (com ara les proteïnes Cry i Cyt), així com proteïnes insecticides que són secretades al medi de cultiu. Entre les últimes, hi ha les proteïnes Vip, que es divideixen en quatre famílies d'acord amb la seva identitat d'aminoàcids. Les proteïnes Vip1 i Vip2 actuen com toxines binàries i són tòxiques per a alguns coleòpters i hemípters. Per la família de les Vip4, que és l’última família de proteïnes Vip descoberta, encara no s’hi coneixen espècies susceptibles. Les proteïnes Vip3 no presenten homologia de seqüència amb cap altra família de proteïnes conegudes i són tòxiques per a una àmplia varietat d’espècies de lepidòpters. El mode d’acció de les Vip3 encara no està completament dilucidat, però s'assumeix una mecanisme similar al de les proteïnes Cry en termes generals (activació proteolítica, unió a la membrana epitelial en forma de raspall de l'intestí mitjà, i formació de porus). Les proteïnes Vip3A no comparteixen els mateixos llocs d’unió amb les proteïnes Cry, per la qual cosa són bones candidates per co-expressar-se amb proteïnes Cry en plantes transgèniques (cultius-Bt) amb la finalitat de prevenir o retardar l’aparició de fenòmens de resistència en insectes susceptibles, i per ampliar l'espectre insecticida. Les proteïnes Vip3A són, per tant, una eina important per a la protecció de cultius contra plagues d'erugues en la protecció integrada de cultius (PIC). Aquesta tesi té com a objectiu principal caracteritzar més profundament la funció i l’estructura de les proteïnes Vip3A. Primerament es va avaluar la toxicitat de 5 proteïnes Vip3A diferents contra 8 espècies d'erugues plaga al capítol 1; les protoxines de Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ad, Vip3Ae i Vip3Af i les seves corresponents formes activades amb tripsina comercial es van assajar per determinar la seva toxicitat contra Agrotis ipsilon, Helicoverpa armigera, Mamestra brassicae, Spodoptera exigua, Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Ostrinia nubilalis i Lobesia botrana. No es van trobar diferències de toxicitat importants entre les formes de protoxina i toxina activada. Les proteïnes Vip3Aa, Vip3Ae i Vip3Af mostraren en general una bona activitat insecticida contra totes les espècies d'insectes amb l'excepció d’ O. nubilalis. De fet, O. nubilalis es va mostrar tolerant a l’acció de les Vip3A i només la Vip3Af va causar una mortalitat marginal. La proteïna Vip3Ad no va resultar tòxica per a cap de les espècies assajades, mentre que la Vip3Af va mostrar un ventall d'activitat més ampli. L’estructura 3D de les proteïnes Vip3A no és coneguda; per esta raó, els següents passos d’esta tesis es centraren en aconseguir un millor coneixement de l’estructura de les proteïnes Vip3A i del seu plegament. Les proteïnes Vip3 s'expressen en forma de precursor el qual necessita un pas previ d’activació mitjançant les proteases del tracte digestiu de l'insecte. Al segon capítol, l'estabilitat d’una Vip3Aa front l’acció de les proteases es va investigar en presència de SDS. La protoxina de la Vip3Aa16 (que té un pes de 89 kDa) es va tractar amb tripsina comercial i amb extracte de proteases de d'intestí mitjà d’ A. ipsilon a concentracions elevades. Quan les reaccions no van ser neutralitzades adientment, els resultats de l'anàlisi de l’electroforesi en SDS-PAGE equívocament sugerien que la protoxina es processa per complet, tot i que la mostra digerida encara retenia íntegrament la toxicitat contra A. ipsilon. No obstant això, quan la reacció proteolítica es va aturar de manera eficient, es va fer patent que la protoxina només s'escindeix en un lloc de tall primari, independentment de la quantitat de tripsina o d’extracte de l’intestí mitjà de l’insecte utilitzat. Els dos pèptids de 66 kDa i de 19 kDa generats com a conseqüència de l’activació co-elueixen després de la cromatografia de filtració en gel, indicant que ambdós romanen units després de l'escissió. Es va confirmar, per tant, que el fragment de 66 kDa és extremadament resistent a l’acció de les proteases i que la degradació observada a l’electroforesi quan la reacció enzimàtica de les proteases no es correctament neutralitzada és producte de la interacció de l’SDS amb la Vip3Aa. Estos resultats es varen reproduir en el capítol 3er amb la proteïna Vip3Af1 i la espècie plaga S. frugiperda. La degradació aparent de la toxina es va observar quan la Vip3Af es va tractar amb la major concentració de peptidases. La Vip3Af aparentment degradada també fou tòxica contra les larves nounades de S. frugiperda. Encara més, quan la Vip3Af que havia estat sotmesa al tractament amb tripsina durant 72h es va tractar amb quantitats addicionals de tripsina, la degradació aparent del pèptid de 62 kDa no es vaobservar més. En conclusió, es proposa que l'activació proteolítica de les proteïnes Vip3A es produeix de manera esglaonada, per mitjà de la qual la protoxina es divideix en dos pèptids principals, seguit d’un canvi subtil de plegament del fragment de 62-66 kDa amb probablement implicat en l’acció insecticida. En el 4t capítol, la tècnica de l’escaneig d'alanina es va realitzar en 558 d'un total de 788 aminoàcids que formen la proteïna Vip3Af1. L’escaneig d'alanina és una tècnica molt utilitzada per identificar i localitzar posicions crucials o epítops en la seqüència d’una proteïna i permet aprofundir en la relació estructura-funció de les proteïnes. De les 558 substitucions analitzades, 19 comprometeren l'expressió de la proteïna i 11 disminuïren considerablement la toxicitat contra S. frugiperda. Les substitucions que van reduir l'activitat insecticida s'agrupen principalment en dues regions de la seqüència (entre els aminoàcids 167-272 i entre els aminoàcids 689-741). La majoria de les substitucions que afectaren l'activitat front S. frugiperda ho feren de manera similar contra A. segetum. La caracterització de la sensibilitat front a proteases de les 11 proteïnes mutants seleccionades per disminuir la toxicitat va revelar 6 patrons de proteòlisi diferents, identificats mitjançant electroforesi en SDS-PAGE. L'estudi de la fluorescència intrínseca de tots els mutants seleccionats només va revelar canvis lleus en el pic d'emissió, indicant que probablement les mutacions provoquen només canvis menors en l'estructura terciària. L’estructura tridimensional de la Vip3Af1 es va predir in silico per primera vegada. Finalment, en el capítol 5è, 12 mutants diferents es van generar mitjançant mutagènesi dirigida en diferents posicions al llarg de la seqüència de la proteïna Vip3Af1. La mutagènesi dirigida és una aproximació comú per a la millora la funcionalitat de les proteïnes, així com per aprofundir en els coneixement de les proteïnes a nivell molecular, especialment quan l'estructura de la proteïna és desconeguda. Deu dels 12 mutants generats es varen expressar amb èxit i tots ells foren funcionalment actius, la qual cosa subratlla l'alta resilència de la seqüència de la Vip3Af1. No va ser possible millorar significativament la potència insecticida contra S. frugiperda en cap de les mutacions. Les mutacions en la posició 689 (G689S, G689E i N682K-G689S), així com les mutacions E483H i W552H van donar patrons proteolítics diferents al perfil natiu de la Vip3Af (tipus salvatge). Els espectres d'emissió de fluorescència intrínseca no suggereixen un canvi en el plegament significatiu. En este capítol es discuteixen les possibles implicacions que les mutacions tenen sobre les interaccions intramoleculars i s’infereix en la conformació de la proteïna. Els resultats obtinguts en esta tesi aporten una millor comprensió de l'estructura i funció de les proteïnes Vip3A. Esta informació és útil per a la presa de decisions quan s'empra B. thuringiensis o les seves proteïnes insecticides com un recurs fitosanitari en els programes de control integrat de plagues i en estratègies de maneig de la resistència .

Modern agriculture demands for more sustainable agrochemicals to reduce the environmental and health impact. Some entomopathogenic bacteria produce insecticidal proteins which accumulate in inclusion bodies or parasporal crystals (such as the Cry and Cyt proteins), as well as insecticidal proteins which are secreted to the culture media. Among the latter, there are the Vip proteins, which are divided into four families according to their amino acid identity. The Vip1 and Vip2 proteins act as binary toxins and are toxic to some Coleoptera and Hemiptera. For the most recently reported Vip4 family, no target insects have been found as yet. Vip3 have no sequence similarity to any other proteins families known and are toxic to a wide variety of Lepidoptera. Its mode of action is yet not completely elucidated but a general mode of action similar to that of the Cry proteins (proteolytic activation, binding to the brush border membrane of the midgut epithelium, and pore formation) is assumed. Vip3A proteins do not share binding sites with Cry proteins, which makes them good candidates to be combined with Cry proteins in transgenic plants (Bt-crops) to prevent or delay insect resistance, and to broaden the insecticidal spectrum. Vip3A are an important tool for crop protection against caterpillar pests in integrated pest management (IPM) strategies. This thesis aimed to deeper characterise the function and structure of the Vip3A proteins. In chapter 1, the toxicity of 5 different Vip3A proteins against 8 different caterpillar pests was first assessed: Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ad, Vip3Ae and Vip3Af and their corresponding trypsin-activated toxins were tested for their toxicity against Agrotis ipsilon, Helicoverpa armigera, Mamestra brassicae, Spodoptera exigua, Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Ostrinia nubilalis and Lobesia botrana. No major differences were found when comparing protoxins vs. trypsin-activated toxins. Vip3Aa, Vip3Ae and Vip3Af displayed overall good insecticidal activity against all insect species with the exception of O. nubilalis, which was found to be tolerant to all Vip3A tested and only marginal mortality was caused by the Vip3Af. Vip3Ad protein was not toxic to any of the tested species whereas Vip3Af showed the broadest range of activity. The·3D-structure of the Vip3A proteins are not known, therefore, consecutives steps were performed to achieve a better insight on the Vip3Aprotein folding and structure. Vip3 proteins are expressed as a precursor that is to be activated by the insect gut proteases. In the 2nd chapter, stability of the Vip3Aa against proteases was investigated in the presence of SDS. Vip3Aa16 protoxin (of 89 kDa) was treated at high concentrations of trypsin and Agrotis ipsilon midgut juice. When the reactions were not properly neutralized, the results of SDS-PAGE analysis (as well as those with Agrotis ipsilon midgut juice) equivocally indicated that the protoxin could be completely processed, although it retained full toxicity against A. ipsilon. However, when the proteolytic reaction was efficiently stopped, there was revealed that the protoxin was only cleaved at a primary cleavage site, regardless the amount of trypsin used. The 66 kDa and the 19 kDa peptides generated by the proteases co-eluted after gel filtration chromatography, indicating that they remain together after cleavage. The 66 kDa fragment was found to be extremely resistant to proteases and that the misleading degradation observed in the SDS-PAGE was a consequence of the inefficient neutralisation of the enzymatic reaction and the interaction of the SDS molecules with the Vip3A protein. These results were reproduced in the 3d chapter with the different Vip3Af protein and the different pest species S. frugiperda. The misleading degradation previously reported for the closely related Vip3Aa16 was also observed in the Vip3Af at the highest concentration of peptidases used. The apparently degraded protein was active against S. frugiperda neonates. When the trypsin-activated toxin was further treated with trypsin, the misleading over-processing of the 62 kDa core was no longer observed in the SDS-PAGE. The proteolytic activation of the Vip3A is proposed to be stepwise fashion, which first step involves the formation of a toxin core of 62-66 kDa fragment that undergoes a subtle folding change likely involved in the insecticidal mechanism. In the 4th chapter, the alanine scanning technique was performed on 558 out of the total of 788 amino acids of the Vip3Af1 protein. Alanine scanning is a successful technique for mapping crucial positions or epitopes in a protein and allows a greater insight into protein structure-function relationships. From the 558 residue substitutions, 19 impaired protein expression and 11 compromised the insecticidal activity against S. frugiperda. Substitutions that reduced insecticidal activity mainly clustered in two regions of the protein sequence (amino acids 167-272 and amino acids 689-741). Most of the substitutions that impaired the activity to S. frugiperda behave likewise to Agrotis segetum, with few exceptions. The characterisation of the sensitivity to proteases of these 11 mutant proteins displaying decreased insecticidal activity revealed 6 different band patterns as evaluated by SDS-PAGE. The study of the intrinsic fluorescence of all selected mutants revealed only slight shifts in the emission peak, likely indicating only minor changes in the tertiary structure. An in silico modelled 3D structure of Vip3Af1 is proposed for the first time. Finally, in the 5th chapter, 12 different mutants were generated by site-directed mutagenesis all along the Vip3Af1 protein sequence. Site-directed mutagenesis is a common approach to function improvement as well as to deepen in the protein knowledge, especially when the protein structure is unknown. Ten of these mutants were successfully expressed and were functionally active, highlighting the high resilience of the Vip3Af1 sequence. None of the Vip3Af mutations caused an improvement of the insecticidal potency against S. frugiperda. Mutations in position 689 (G689S, G689E and N682K-G689S), as well as mutations E483H and W552H gave proteolytic patterns different to the native profile of the wild type. The intrinsic emission fluorescence spectra did not show a significant folding change. Implications on the intramolecular interactions and on the conformation of the protein are further discussed. The results obtained in this Thesis give to a better understanding of the protein structure and function of Vip3A proteins, which will be helpful for the decision making when and how using B. thuringiensis or its insecticidal proteins as a phytosanitary resource in pest management programs and resistance management strategies