Lógica de regulación transcripcional de las neuronas serotonérgicas en Caenorhabditis elegans La diversidad del sistema nervioso se genera mediante la activación de múltiples baterías únicas de genes efectores, que definen las propiedades funcionales de los diferentes subtipos neuronales. Está bien establecido que los factores de transcripción (FT) se unen de una manera combinatoria y cooperativa a secuencias de ADN presentes en los elementos de regulación en cis del genoma, llamados potenciadores (enhancers en inglés). Esto otorga a los FT un papel central en la regulación de la expresión génica. Sin embargo, no se conocen los mecanismos por los que estas combinaciones de FT identifican y activan sus secuencias diana. En este trabajo se han utilizado las neuronas serotonérgicas como paradigma de investigación de las leyes que regulan la selección del transcriptoma de un tipo neuronal concreto durante la diferenciación terminal. Las neuronas serotonérgicas se encuentran presentes en todos los grupos de eumetazoos y se definen por su habilidad de sintetizar y liberar serotonina (5-HT), lo cual es posible gracias a la expresión de los llamados ‘genes de la vía de la 5-HT’. Aprovechando esta conservación filogenética, hemos utilizado el organismo modelo Caenorhabditis elegans para diseccionar la lógica de regulación transcripcional de las neuronas serotonérgicas. Los hermafroditas C. elegans contienen tres subclases de neuronas serotonérgicas con diferente función: la neurona motora HSN, la neurona secretora ADF y la neurona motora neurosecretora NSM. Mediante un análisis de regulación in vivo de los genes de la vía de la 5-HT, hemos identificado módulos de regulación en cis (MRC) independientes responsables de su expresión en cada uno de los tres subtipos serotonérgicos. Esta organización modular sugiere que cada subclase utiliza una lógica de regulación diferente. Para profundizar en los mecanismos de selección y activación del transcriptoma específico de un tipo neuronal decidimos enfocar el resto de nuestro trabajo en el estudio de la neurona HSN, por ser la mejor caracterizada hasta la fecha. El análisis de mutantes de pérdida de función, junto con el estudio detallado de los MRC de la neurona HSN, revelan que un código de seis FT es capaz de activar directamente el transcriptoma de la neurona HSN. Este código, al que hemos llamado ‘Colectivo de FT de HSN’, está formado por AST-1 (de la familia de FT ETS), UNC-86 (POU), SEM-4 (SPALT), HLH-3 (bHLH), EGL-46 (INSM) y EGL-18 (GATA). Esta combinación, es suficiente, en algunos contextos celulares para la inducción del fenotipo serotonérgico y necesario durante toda la vida del animal para mantener la identidad de la neurona HSN. Por otro lado, estudios bioinformáticos de predicción de sitios de unión para los seis FT del código, muestran que los genes expresados en la neurona HSN están enriquecidos en la presencia de agrupaciones de estos seis sitios de unión, en comparación a un conjunto de genes elegidos al azar. Mediante el análisis de reporteros in vivo, demostramos que esta agrupación constituye una huella reguladora que es suficiente para la identificación de nuevos potenciadores funcionales para la neurona HSN. Además, esta huella reguladora contiene normas sintácticas que mejoran la predicción de potenciadores expresados en la célula. Curiosamente, el programa de diferenciación de las neuronas serotonérgicas en ratón está controlado por FT que son ortólogos a los del nematodo. Esta elevada homología en la regulación nos ha permitido identificar nuevos candidatos a regular las neuronas serotonérgicas del gusano (PHA-4, ortólogo a FOXA2) y del ratón (SALL2, ortólogo a SEM-4). Asimismo, los ortólogos de ratón son capaces de sustituir funcionalmente a los FT equivalentes en gusano. Finalmente, el Análisis de Coordenadas Principales sugiere que, de entre todas las neuronas del gusano, el transcriptoma de la neurona HSN es el que más se asemeja a aquel de las neuronas serotonérgicas de ratón, revelando relaciones de homología profunda. En conclusión, hemos demostrado que la presencia de una huella reguladora basada en un conjunto definido de FT es suficiente para identificar potenciadores, utilizando únicamente la secuencia primaria de ADN. Además, hemos identificado las reglas que gobiernan el código de regulación transcripcional de un tipo neuronal relevante en dos especies separadas hace más de 700 millones de años.

Serotonergic transcriptional regulatory logic in Caenorhabditis elegans Neuronal diversity in the nervous system is generated through the activation of multiple unique batteries of terminal differentiation genes, which determine the functional properties of the distinct mature neurons. It is generally accepted that transcription factors (TFs) bind in a combinatorial and cooperative manner to DNA sequences of the genome called enhancers, placing TFs as the main regulators of gene expression. However, how these combinations of TFs identify and activate their target sequences is poorly understood. In this work we use as a paradigm the serotonergic neurons to unravel the regulatory rules that select a cell type-specific transcriptome during terminal differentiation. Serotonergic neurons are present in all eumetazoan groups and are universally defined by their ability to synthesise and release serotonin (5-HT), which is achieved by the expression of the ‘5-HT pathway genes’. Taking advantage of this phylogenetic conservation, we use the simple model organism Caenorhabditis elegans to dissect the transcriptional regulatory logic of serotonergic neurons. C. elegans hermaphrodites have three functionally different serotonergic subclasses: the HSN motorneuron, the ADF sensory neuron and the NSM neurosecretory motorneuron. All three neuron subtypes express the 5-HT pathway genes. Through an in vivo cis-regulatory analysis of these genes we have identified independent cis-regulatory modules (CRM) responsible for their expression in each serotonergic neuron subtype. This modular organisation suggests that different regulatory logics are employed in each neuron subclass to activate its terminal transcriptome. To deepen in our understanding of how cell type-specific transcriptional programmes are implemented we decided to focus the rest of our work on the best characterised serotonergic neuron subtype, the HSN neuron, and carried out an extensive dissection of HSN terminal differentiation transcriptional rules. Loss of function mutant and cis-regulatory analyses reveal that direct activation of the HSN transcriptome is orchestrated by a code of six TFs, that we have termed HSN TF collective. This TF code is composed by AST-1 (ETS TF family), UNC-86 (POU TF family), SEM-4 (SPALT TF family), HLH-3 (bHLH TF family), EGL-46 (INSM TF family) and EGL-18 (GATA TF family). The expression of the HSN TF collective is sufficient to induce serotonergic fate in some specific contexts and is required throughout the life of the animal in order to maintain the identity of the HSN neuron. Bioinformatically identified binding site clusters for the six TFs of the HSN TF collective are enriched in known HSN expressed genes compared to a random set of genes. Through in vivo reporter analysis, we demonstrate that this clustering constitutes a regulatory signature that is sufficient for de novo identification of HSN neuron functional enhancers. This regulatory signature contains certain syntactic constrains that further improve the prediction of enhancer expression in the cell. Mouse orthologues of most members of the HSN TF collective are known regulators of the mammalian serotonergic differentiation programme. This homology in both serotonergic regulatory programmes allows for the identification of an additional candidate TF in the worm (PHA-4), orthologue to the mouse FOXA2, and a mouse TF (SALL2), orthologue of the worm SEM-4. Moreover, we prove that mouse orthologues can functionally substitute for their worm counterparts. Finally, Principal Coordinates Analysis suggests that, among C. elegans neurons, the HSN transcriptome most closely resembles that of mouse serotonergic neurons, which reveals deep homology. Our results show that a regulatory signature based on a defined set of TFs is sufficient for enhancer identification using primary DNA sequence. Moreover, our results identify rules governing the transcriptional regulatory code of a critically important neuronal type in two species separated by over 700 million years.