El endotelio es un tejido dinámico que juega un papel fundamental en el mantenimiento de la función vascular. Está localizado en la capa interna de los vasos sanguíneos, linfáticos y corazón, y resulta clave para las diversas funciones del sistema cardiovascular, tales como la hemostasia, la regulación del tono vascular, la respuesta inflamatoria, la regulación de la permeabilidad vascular y la angiogénesis. El endotelio actúa como una diana de los estrógenos y expresa ambos tipos de receptores de estrógenos (ER): los nucleares clásicos ERα and ERβ, que actúan como factores de transcripción, y el receptor acoplado a proteína G (GPER). Mientras que la unión de estrógenos a ERα y ERβ modula la expresión génica a través de su unión a elementos de respuesta a estrógenos (ERE), las acciones rápidas inducidas por estrógenos son llevadas a cabo a través de GPER y de otros ER asociados a membrana. Los estrógenos regulan la función endotelial a través de diferentes mecanismos, entre los que destaca la modulación de la expresión génica a nivel transcripcional. Sin embargo, la regulación por ácidos ribonucleicos (RNA) no codificantes ha surgido como un mecanismo clave en la modulación del perfil de expresión génica. Entre ellos, predominan los microRNA (miRNA) y se caracterizan por mediar la represión de la traducción génica a través de interacciones específicas con sus genes diana. En los últimos años, los miRNA han generado un gran interés en la regulación de la expresión génica en general, aunque su papel en la respuesta a estrógenos en células endoteliales no ha sido estudiado. Por esta razón, el objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido estudiar el papel de los miRNA en los efectos que ejercen los estrógenos en cultivos de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Para ello, se determinaron los cambios globales en el perfil de expresión de miRNA inducidos por 17β-estradiol en HUVEC mediante técnicas de microarrays. Los resultados se analizaron con herramientas bioinformáticas y se obtuvieron diferentes rutas moleculares en las que los miRNA estaban regulados por estradiol. Se observó que concentraciones fisiológicas de estradiol (1 nmol/l) inducían cambios en el perfil de expresión de miRNA. Concretamente variaron significativamente 114, de los que 70 incrementaron su nivel de expresión y 44 fueron reprimidos. El ratio de cambio varió entre -1,76 y 2,02. De entre estos 114 miRNA, los que mostraron un mayor cambio de expresión (miR-30b, miR-487a, miR-4710, miR-501, miR-378h y miR-1244) fueron validados mediante qRT-PCR. Además, el análisis funcional puso de manifiesto la asociación de los miRNA modulados por estradiol con rutas moleculares clave en la regulación de la función vascular en estado fisiológico y fisiopatológico. Por otra parte, el papel de los ER en la regulación de miRNA fue evaluado mediante dos aproximaciones: por la presencia de sitios de unión específicos para ER en las regiones promotoras de los miRNA validados y a través de una aproximación farmacológica, mediante el uso de agonistas y antagonistas específicos de los diferentes ER. Nuestros resultados mostraron que los cambios en la expresión de miRNA inducidos por estradiol estaban mediados por los ER. Si bien ERβ y GPER estaban implicados en cambios de expresión de algunos miRNA, como miR-501-3p y miR-4710 respectivamente, otros estaban regulados por ERα, como miR-30b-5p, miR-487a-5p y miR-378h. Finalmente, se observó en la expresión del miR-1244 una la regulación inespecífica a través de diferentes receptores de estradiol. Mediante el análisis integrado de la interacción entre miRNA y mRNA, utilizando para ello datos de microarray de mRNA previamente publicados por nuestro grupo (Sobrino et al., 2009), se incrementó la especificidad del proceso de identificación de las interacciones miRNA-mRNA. De ese modo, se identificó el perfil de asociaciones miRNA-mRNA inducidas por estradiol, así como su implicación en rutas reguladoras específicas. La caracterización funcional destacó la ruta de señalización ERK/MAPK entre las rutas canónicas en las que estaban implicados los miRNA regulados por estradiol. Además, otras rutas de señalización vascular, como las relacionadas con integrinas, endotelina (ET)-1 y eNOS, también fueron identificadas entre las cuales los miRNA regulados por estradiol en células endoteliales estarían implicados. Los últimos estudios se centraron en el miR-30b-5p, por ser el que más se inducía por estradiol en HUVEC. Mediante estudios de transfección celular con inhibidores y miméticos del miR-30b-5p se determinó su papel en la regulación de las dianas que previamente se habían predicho. Tanto el estradiol como el mimético de miR-30b-5p regularon la expresión génica de las dianas predichas para miR-30b-5p, como el factor de transcripción ELK4. Además, mediante el análisis bioinformático se determinó que el gen de la ET-1, cuya expresión estaba disminuida en los datos del array de expresión de mRNA, poseía sitios de unión para ELK4. Por tanto, la disminución de la expresión de ELK4 y de ET-1 observada en células endoteliales expuestas al mimético de miR-30b-5p sugería una posible función de la interacción de miR-30b-5p con ELK4 en la inhibición de ET-1 inducida por estradiol en células endoteliales. En resumen, los resultados obtenidos ofrecen por primera vez el perfil de expresión de miRNA inducido por estradiol en células endoteliales humanas. Además, se han identificado diferentes procesos biológicos relacionados con miRNA que están regulados por estradiol a través de sus receptores. En concreto, en este trabajo se ha descrito la regulación de ET-1 por el miR-30b-5p inducido por estradiol. Por todo ello, considerando la implicación de la ET-1 en la disfunción endotelial, aterosclerosis e hipertensión, estos resultados podrían abrir un campo inexplorado en la mejora de la función endotelial mediante la utilización del miR-30b-5p como una nueva aproximación terapéutica.

Endothelium is a highly dynamic tissue with a key role in the correct regulation of vascular function. Endothelium, which is located in the inner layer of blood and lymphatic vessels and heart, modulates several functions of cardiovascular system, such as haemostasis, regulation of vascular tone, response to inflammatory processes, as well as, regulation of vascular permeability and angiogenesis. Endothelium acts as estrogen target since it expresses both types of estrogen receptors (ER), the classic nuclear transcription factors ERα and ERβ, and the most recently described G protein-coupled ER (GPER). Whereas ERα and ERβ modulate gene expression through binding to estrogen response elements (ERE) in the promoter region of estrogen-responsive genes, rapid estrogen signalling is mediated through membrane-associated ER and GPER. Estrogen regulation of endothelial function is mediated by several mechanisms, by way of direct and indirect modulation of gene transcription machinery. In addition, regulation through non-coding ribonucleic acid (RNA) has emerged as a key mechanism modulating gene expression profile. Among them, microRNA (miRNA) are the most predominant class and they induce translation repression via sequence-specific interactions with target genes. Although gene expression regulation mediated by miRNA has received a lot of attention in the last years, the role of estrogens on endothelial gene regulation through miRNA-based mechanisms has been less studied. Therefore, the main objective of the present work was to study the role of miRNA in the estradiol-mediated effects in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). First, global changes in the miRNA expression profile induced by estradiol in endothelial cells was evaluated using microarrays technology, and results were analysed using bioinformatics tools in order to obtain related pathways regulated by estradiol-sensitive miRNA. Results revealed that physiological concentration of estradiol (1 nmol/l) induced changes in the miRNA expression profile of endothelial cells. Specifically, 114 miRNA were regulated by estradiol, including 70 up-regulated and 44 down-regulated miRNA. Fold changes of estradiol-regulated miRNA range from -1.76 to 2.02. Among them, the most differentially expressed miRNA (miR-30b, miR-487a, miR-4710, miR-501, miR-378h and miR-1244) were validated by qRT-PCR. Functional analysis revealed that estradiol-modulated miRNA were associated to key molecular pathways, which were important to regulate vascular physiology in health and disease. Additionally, the role of ER in estradiol-induced miRNA was evaluated by both an in silico approach evaluating specific ER binding sites in the promoter region of selected miRNA and a pharmacological approach by modulation of ER with specific agonists and antagonists. Our results show that changes in estradiol-induced miRNA expression were mediated through ER. Most of selected estradiol-regulated miRNA were regulated by ERα. Specifically, estradiol-dependent changes in miR-30b-5p, miR-487a-5p and miR-378h expression were mediated by ERα. In a lesser extent, ERβ and GPER were also implicated in miRNA expression changes after estradiol treatment in endothelial cells. Changes in miR-501-3p and miR-4710 expression were related to ERβ and GPER action, respectively. Additionally, estradiol-dependent regulation of miR-1244 could also be mediated via the different ER in HUVEC. Furthermore, an integrated miRNA-mRNA analysis was performed using mRNA microarray data of estradiol-treated HUVEC previously obtained by our group (Sobrino et al., 2009), increasing the process-specificity of predicted miRNA-mRNA pairings. Thereby, we identified miRNA-mRNA signature induced by estradiol as well as their implication in specific regulatory networks. Indeed, functional characterization highlighted ERK/MAPK signalling among canonical pathways in which estradiol-regulated miRNA were involved. Integrin, endothelin (ET)-1 and eNOS signalling, which regulate important vascular functions, were among regulated pathways in estradiol-treated endothelial cells. miR-30b-5p, the miRNA that exhibited the greatest up-regulation in estradiol-exposed HUVEC, was selected to further study. For this purpose, cell transfection with miRNA inhibitor and miRNA mimic was used to determine the role of miR-30b-5p regulating predicted mRNA targets. Estradiol and miR-30b-5p mimic regulated gene expression of different miR-30b-5p predicted targets, including the transcription factor ELK4. Moreover, ET-1 was among putative estradiol-regulated genes with ELK4 binding sites after an in silico analysis. When endothelial cells were exposed to miR-30b-5p mimic, decreased ELK4 and ET-1 expression was observed, suggesting the importance of miR-30b-5p/ELK4 association in estradiol-dependent inhibition of ET-1 in endothelial cells. In summary, the obtained results provide for the first time an estradiol-mediated miRNA expression profile in endothelial cells, and information about biological processes related to estradiol-regulated miRNA. Specifically, the ET-1 regulation by estradiol-dependent miR-30b-5p has been studied. Due to increasing evidences suggesting the implication of ET-1 in endothelial dysfunction, atherosclerosis and hypertension, our results could open up an unexplored field by using miR-30b-5p as a new therapeutic approach aimed to improve endothelial function.