RESUMEN INTRODUCCIÓN Diversos agentes hepatotóxicos y enfermedades hepáticas pueden conducir al desarrollo de fibrosis hepática debido a la presencia de respuestas inflamatorias desreguladas (Kubes and Mehal 2012). Tanto la inflamación hepática como la fibrogénesis son procesos mediados por conocidas vías reguladas por el factor de transcripción NF-κB y por los inflamasomas, complejos multiproteicos intracelulares que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos y a daño (PAMPs y DAMPs) (Martinon et al. 2009; Gurung et al. 2015). NLRP3 es el inflamasoma más ampliamente estudiado, habiéndose involucrado en el inicio y progresión de varios procesos hepáticos, como son el daño hepático inducido por fármacos, el hígado graso no alcohólico y la fibrosis hepática (Friedman et al. 2013; Mehal 2014; Szabo and Iracheta-Vellve 2015; Tilg et al. 2016). El inflamasoma NLRP3 está compuesto por varios dominios, concretamente el receptor NLRP3 (NOD-like receptor protein 3), el adaptador proteico ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, codificado por el gen PYCARD) y la serina proteasa caspasa-1 (Latz et al. 2013; Netea et al. 2015). Tras la detección de patrones moleculares nocivos para la célula, la pro-caspasa-1 es procesada y activada dando lugar a caspasa-1 induciendo así la maduración de interleucina (IL)-1β e IL-18, que son liberadas de las células mediante vías no convencionales, incluidas el transporte en micropartículas o a través de la muerte celular por piroptosis (Lopez-Castejon and Brough 2011; Brydges et al. 2013; Dinarello et al. 2013; Sollberger et al. 2014). El inflamasoma NLRP3 es activado en repuesta a una amplia variedad de estímulos que frecuentemente están relacionados con la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO), la liberación de proteínas mitocondriales al citosol, la homeostasis del Ca2+ y el estrés de retículo endoplásmico (RE) (Gurung et al. 2015). A este respecto, estudios in vitro han descrito que efavirenz (EFV), uno de los fármacos antirretrovirales más ampliamente utilizados en el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), modifica la expresión de ciertos genes relacionados con la inflamación (Gomez-Sucerquia et al. 2012) y ejerce una serie de acciones en los hepatocitos que pueden desencadenar la inducción del inflamasoma NLRP3 y la subsiguiente inflamación hepática. Entre estas acciones se encuentra el incremento de la producción de ERO, la perturbación de la homeostasis del Ca2+, la disfunción mitocondrial, la activación de la autofagia para promover la supervivencia celular y el estrés de RE (Apostolova et al. 2010, 2011, 2013; Blas-García et al. 2010). La fibrogénesis es una respuesta multicelular estrechamente relacionada con la activación de rutas inflamatorias, durante la cual las células estrelladas hepáticas (CEHs) interaccionan con células residentes en el hígado y células inmunitarias (Seki and Schwabe 2015) desencadenando varios procesos, como cambios en la producción de proteínas de la matriz extracelular (MEC) y citoquinas, que exacerban la inflamación (Friedman 2008). Después de la iniciación y perpetuación del daño hepático, la regresión y/o resolución del mismo son mediadas por diferentes mecanismos, incluyendo la desactivación de las CEHs y la activación del sistema inmune. Concretamente, los macrófagos hepáticos son piezas fundamentales en la homeostasis y patogénesis hepática, llevando a cabo un complejo papel tanto en la inflamación hepática como en la resolución del daño (Tacke and Zimmermann 2014). En el contexto de nuestro estudio, es importante destacar que algunos de los procesos fisiopatológicos involucrados en la activación de las CEHs han sido atribuidos al tratamiento con EFV (Hernández-Gea et al. 2012, 2013), y que se ha demostrado que el VIH induce directamente la secreción de citoquinas y producción de colágeno en CEHs (Tuyama et al. 2010). La proteína sequestosome 1 (SQSTM1) /p62 /A170 o ZIP3 (a partir de aquí p62), es una proteína de 62 kDa expresada en la mayoría de los tejidos e inducida por estrés celular. Está codificada por un gen de respuesta rápida (SQSTM1) que se activa por una amplia variedad de señales extracelulares relacionadas con la proliferación celular, diferenciación y, particularmente, estrés oxidativo (Ishii et al. 2013). En los últimos años, múltiples evidencias han mostrado su implicación en patologías humanas causadas por defectos en la homeostasis proteica, como en las enfermedades neurodegenerativas de Alzheimer y Parkinson (Kuusisto et al. 2001; Geetha et al. 2012), así como por mutaciones en SQSTM1, como ocurre en enfermedades óseas (Laurin et al. 2002) y enfermedades neuronales (Rea et al. 2014). Además, un aumento de la actividad de p62 ha sido relacionado con carcinogénesis, bien debido a una potenciación de la expresión de la proteína (Puissant et al. 2012; Moscat et al. 2016) o por su anormal acumulación debido a defectos en la autofagia (Mathew et al. 2009). Sin embargo, el papel de p62 en los efectos adversos de los fármacos utilizados en clínica no ha sido estudiado en profundidad. p62 es una proteína multifuncional, ya que contiene una serie de dominios que le permiten interaccionar con una amplia variedad de rutas de transducción involucradas en la proliferación, supervivencia y muerte celular. Esta proteína está involucrada en la activación de la ruta de señalización de Keap1-Nrf2 a través de un mecanismo de retroalimentación positiva en el que la transcripción de SQSTM1 es incrementada por Nrf2 (Jain et al. 2010; Puissant et al. 2012). Un segundo papel de p62 es coordinar los procesos reguladores mediados por la ubiquitina (Nezis and Stenmark 2012; Puissant et al. 2012), facilitando la degradación dependiente del proteasoma de proteínas ubiquitinadas (Harper and Schulman 2006). p62 también participa en el proceso autofágico a distintos niveles, ya que permite la activación de mTORC1 en los lisosomas y puede actuar como receptor para la autofagia de proteínas ubiquitinadas que se encuentran agregadas en los llamados “cuerpos de p62” (Pankiv et al. 2010). Además, p62 es en sí mismo un substrato para la autofagia selectiva y es frecuentemente utilizado como marcador del flujo autofágico (Manley et al. 2013; Katsuragi et al. 2015). Numerosas evidencias han asociado p62 con vías de señalización que controlan la inflamación. De esta forma, la implicación de p62 en la función de los inflamasomas es variada; por ejemplo, se ha mostrado que p62 es esencial para controlar la activación del inflamasoma NLRP3, actuando en la inhibición de la actividad del inflamasoma a través de su participación en la autofagia, permitiendo así la degradación de los inflamasomas activos (Zhong et al. 2016). Por otra parte, esta proteína multifuncional también se ha descrito como un actor fundamental en la fisiología normal de la mitocondria, ya que su depleción produce un aumento de la fisión mitocondrial, caída del potencial de membrana (ΔΨm) y pérdida de la integridad del ADN mitocondrial (Seibenhener et al. 2013). OBJETIVOS El objetivo general de este estudio fue explorar las respuestas inflamatoria y fibrogénica agudas inducidas por el fármaco antirretroviral EFV en células hepáticas, así como profundizar en los mecanismos moleculares y celulares implicados en su regulación, empleando modelos in vitro e in vivo. Los objetivos específicos abordados para alcanzar el objetivo general fueron: 1. Evaluar si la disfunción mitocondrial y estrés de RE inducido por EFV en hepatocitos están asociados con una activación de la respuesta inflamatoria a través de las vías dependientes de NF-κB y del inflamasoma NLRP3. 2. Caracterizar los efectos de EFV en CEHs, con respecto a la función mitocondrial, el estrés de RE, y la autofagia, con especial énfasis en la lipofagia. 3. Analizar el papel de EFV en la activación del inflamasoma NLRP3, y en la inducción de respuestas inflamatorias y fibrogénicas en CEHs. 4. Determinar el papel de los macrófagos hepáticos en la inducción y/o progresión del daño hepático inducido por EFV. 5. Evaluar la expresión y localización sub-celular de p62 en células hepáticas tratadas con EFV, que constituye un modelo de flujo autofágico activado y disfunción mitocondrial/estrés de RE. 6. Analizar la función de p62 en la disfunción mitocondrial y respuesta inflamatoria inducida en hepatocitos por EFV. RESULTADOS Salvo que se indique lo contrario, los tratamientos fueron realizados con concentraciones clínicamente relevantes de EFV durante 24 h. Efectos de efavirenz en las rutas inflamatorias en células Hep3B Activación de la ruta de señalización de NF-κB EFV indujo la translocación nuclear de NF-κB en la línea celular de hepatoma humano Hep3B, tal y como demuestran la reducción de los niveles proteicos de su inhibidor IκB-⍺, y el incremento de la expresión proteica de la subunidad p65 de este factor de transcripción en los extractos nucleares, acciones que ocurren de forma dependiente de la concentración del fármaco. Además, EFV aumentó la expresión de diferentes genes relacionados con la inflamación y comúnmente relacionados con este factor de transcripción, tales como IL6, SERPINE1 y TNF. Activación del inflamasoma NLRP3 EFV potenció significativamente la transcripción de NLRP3 y de su citoquina efectora IL1B, mientras que la expresión de IL18 fue reducida con la concentración más baja evaluada de EFV (10 µM). La activación del inflamasoma NLRP3 fue confirmada por una profunda reducción de la expresión proteica de la pro-caspasa-1 y un aumento de la actividad de la caspasa-1 en las células tratadas con EFV. Efectos de efavirenz en las rutas inflamatorias y activación de las células LX-2 Inducción de estrés celular: mitocondria y retículo endoplásmico EFV produjo disfunción mitocondrial de forma dependiente de la concentración en células LX-2 (línea celular humana de CEHs), reduciendo el ΔΨm e induciendo la producción de ERO de origen mitocondrial. Las células tratadas con EFV también mostraron una masa mitocondrial aumentada, aunque tan solo con la mayor concentración (50 µM). Además, la expresión proteica de dos importantes mediadores de estrés de RE, GRP78 y CHOP, fue aumentada de manera significativa y concentración-dependiente, si bien ensayos de microscopía de fluorescencia solo mostraron alteraciones en la apariencia del RE en las células tratadas con EFV 50 µM. Estos resultados muestran que EFV induce en esta línea celular un perfil de alteraciones similar al previamente descrito en hepatocitos (Apostolova et al. 2010, 2013), aunque las células LX-2 parecen menos vulnerables al daño celular inducido por EFV. Degradación de lipid droplets intracelulares por autofagia La autofagia es un proceso celular involucrado en la activación de las CEHs para proporcionar energía a través de la hidrólisis de lípidos neutros (lipid droplets). La evaluación del contenido lipídico intracelular reveló una respuesta diferencial entre las concentraciones de EFV, ya que 10 y 25 µM disminuyeron la intensidad de señal del marcador de lípidos Rojo Nilo, mientras que 50 µM indujo un ligero incremento en este parámetro. La incubación con el inhibidor autofágico 3MA, revertió esta disminución en las células tratadas con EFV 25 µM, sugiriendo, por tanto, un papel de la autofagia. El análisis de la intensidad de fluorescencia del marcador lisosomal, Lysotracker Green, que actúa como un indicador del flujo autofágico, mostró un incremento significativo solo con 50 µM. Además, EFV indujo un aumento en la expresión del marcador de autofagia LC3-II, sugiriendo una inducción de la autofagia en las CEHs tratadas con este fármaco. Con el objetivo de valorar si EFV estaba activando la lipofagia en CEHs, analizamos el índice de correlación entre el marcador autofágico LC3 y la señal Rojo Nilo, mediante experimentos de microscopía confocal que revelaron un solapamiento significativo y concentración-dependiente de ambas señales, confirmando de esta forma la inducción de la degradación autofágica de lipid droplets. Modulación de la respuesta inflamatoria en células LX-2 Tras determinar los efectos perjudiciales de este fármaco antirretroviral en la función celular, evaluamos si estas acciones podrían llevar a la activación del inflamasoma NLRP3 y producción de citoquinas en CEHs, que potenciarían la repuesta inflamatoria de los hepatocitos. EFV aumentó la transcripción de NLRP3 en estas células e indujo la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, concretamente IL1B, IL6 y TNF y, al igual que en células Hep3B, no se observaron cambios en los niveles de expresión de IL18. El perfil pro-inflamatorio sugerido por los análisis de RT-PCR cuantitativa, fue confirmado realizando un array en el que EFV potenció la expresión de estos genes analizados por RT-PCR cuantitativa, y de otros genes implicados en la inflamación y estrés celular, tales como CASP1, IL33, PYCARD y PANX1. Como se esperaba, el análisis por Western Blot (WB) de extractos proteicos totales de células LX-2 tratadas con EFV, reveló una expresión significativamente incrementada del receptor NLRP3. Experimentos adicionales corroboraron la activación del inflamasoma NLRP3, ya que células LX-2 incubadas con 25 o 50 µM de EFV mostraron un incremento en la actividad de la caspasa-1 y un aumento de la secreción de IL-1β. Activación de rutas fibrogénicas Los resultados obtenidos muestran que EFV potencia significativamente la transcripción de mediadores relacionados con CEHs activadas, tales como los marcadores de fibrogénesis (TGFB1) y de degradación alterada de la MEC (TIMP1, MMP2 y MMP9), aunque no se observaron cambios significativos en la expresión de COL1A1. Efectos de efavirenz en la función y fenotipo de los macrófagos derivados de células U937 Los resultados obtenidos en un array similar al realizado en células LX-2 demostraron una reducción en la expresión de algunos componentes del inflamasoma, tales como NLRP3 y CASP1 en macrófagos, mientras que otros fueron ligeramente sobre-expresados, concretamente PYCARD e IL1B. En lo que respecta a la ruta purinérgica, observamos una expresión aumentada de P2XR7, que codifica el receptor P2X7, aunque los niveles de expresión de PANX1 fueron similares a los encontrados en las células tratadas con vehículo. EFV también indujo un incremento significativo, y dependiente de la concentración, de varios mediadores que pueden tener una acción anti-inflamatoria en los macrófagos, tales como NLRP12 y RIPK2. Por otra parte, el análisis de las proteínas NLRP3 y caspasa-1 por WB no reveló cambios significativos, mientras que la expresión proteica del factor de transcripción anti-inflamatorio PPAR-γ se vio incrementada significativamente en los macrófagos tratados con EFV. La influencia del tratamiento con este fármaco en la polarización de los macrófagos hacia los fenotipos M1 o M2 fue evaluada mediante el análisis de la expresión génica de marcadores específicos. Nuestros resultados sugieren que en macrófagos derivados de la línea celular de monocitos U937, EFV incrementa la expresión tanto de marcadores del fenotipo M1 (NOS2 y CD86) como del M2 (ARG1 y MRC1) promoviendo la resolución de la respuesta inflamatoria inicial. Efavirenz induce efectos similares en células primarias hepáticas El tratamiento con EFV en hepatocitos y CEHs primarias humanas reprodujo los mismos patrones de expresión génica que los previamente detectados en las líneas celulares humanas. De hecho, las alteraciones observadas fueron substancialmente más intensas en las células primarias que en las líneas celulares. Además, los resultados obtenidos en las células de Kupffer confirmaron la polarización inducida por EFV hacia el fenotipo anti-inflamatorio M2, tal y como demuestran la reducción de los marcadores del fenotipo M1 y el incremento de marcadores de M2. Los resultados obtenidos en células primarias validan los modelos celulares empleados y sugieren un papel dual de EFV en la progresión del daño hepático. La depleción de las células de Kupffer modula los efectos hepáticos de efavirenz en un modelo in vivo La expresión de genes pro-inflamatorios y fibrogénicos en tejido hepático completo de ratones C57BL/6 tratados con EFV difiere de la obtenida in vitro en hepatocitos y CEHs, ya que ninguno de los genes evaluados fue significativamente incrementado en las muestras hepáticas. Con el objetivo de evaluar si esta discrepancia entre los resultados obtenidos in vitro e in vivo era resultado de una neutralización in vivo de los diferentes efectos inducidos por EFV en hepatocitos, CEHs y macrófagos, se realizaron experimentos co-administrándoles EFV y GdCl3 a los ratones. La inyección intravenosa de este último compuesto indujo la depleción selectiva de los macrófagos en el hígado, como fue demostrado por la reducción de la expresión del marcador macrofágico F4/80 (evaluado mediante RT-PCR cuantitativa, inmunohistoquímica y WB). Las respuestas obtenidas en el tejido hepático de los ratones tratados con EFV estuvieron en línea con aquellas observadas en las células LX-2 y Hep3B. Concretamente, los ratones tratados con EFV y GdCl3 mostraron un aumento de marcadores fibrogénicos (Col1a1, Acta2, Vim, Timp1 y Mmp2), e inflamatorios y de daño (Tnf, Il33 y Nos2). Sin embargo, no se observaron cambios significativos en la expresión de los componentes del inflamasoma NLRP3 y de Tgfb1, descartando así la participación de estas vías en el papel resolutivo de los macrófagos en los ratones tratados con EFV. Además, la expresión de la citoquina anti-inflamatoria IL-10 fue significativamente reducida por EFV solo en los animales con descenso en los niveles de macrófagos. Finalmente, el ensayo de actividad de la mieloperoxidasa confirmó una potenciación de la respuesta inflamatoria en los ratones tratados con EFV y GdCl3, y demostró que la administración de este fármaco antirretroviral a dosis superiores aumenta la actividad de esta enzima, incluso sin la depleción de los macrófagos. Efectos de efavirenz en la expresión de p62 en hepatocitos El análisis de la expresión proteica de p62 por WB en extractos de proteínas totales obtenidos de células Hep3B tratadas con EFV indicó un incremento concentración-dependiente . Con el objetivo de explorar el marco temporal de este efecto, estudiamos la expresión de p62 en células Hep3B tratadas durante 4, 8, 24 y 48 h. Observamos que los niveles proteicos de p62 son ya incrementados de forma significativa a las 4 h, alcanzando el valor máximo a las 24 h de exposición y que continuaron elevados a las 48 h. Cabe destacar que en células Hep3B carentes de mitocondrias funcionales (fenotipo rhoº), el incremento en la expresión de p62 fue significativamente menor, apuntando al hecho de que la mitocondria juega un papel importante en la activación de p62. Finalmente, el análisis de la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa reveló que EFV produce un incremento significativo en los niveles de ARN mensajero de p62 en células Hep3B. Este hallazgo fue reproducido en hepatocitos humanos, descartando así la posibilidad de que este incremento estuviera relacionado con la naturaleza tumoral de las células Hep3B y confirmando nuestros resultados previos que indican que estas células son un modelo fiable para estudios farmacológicos. Las células Hep3B co-tratadas con EFV y actinomicina D, un inhibidor de la transcripción génica, no mostraron aumentos en la expresión de la proteína p62, sugiriendo que esta potenciación en los niveles de p62 tiene lugar a nivel transcripcional. Regulación de la localización sub-celular de p62 en células Hep3B tratadas con efavirenz Una vez analizada la expresión proteica de p62 en extractos celulares totales, se exploró la presencia de esta proteína en los diferentes compartimentos sub-celulares, mediante el análisis de los niveles de expresión proteica de p62 en extractos proteicos de fracciones enriquecidas en mitocondrias y comparados con los de la fracción citosólica. La pureza de estas fracciones fue corroborada con la expresión de los marcados proteicos: porina (proteína mitocondrial) y actina (proteína del citoesqueleto). EFV indujo un incremento significativo de p62 en ambas fracciones, aunque este incremento fue significativamente mayor en la fracción mitocondrial, señalando de nuevo al importante papel de la mitocondria en la regulación de la expresión de esta proteína ante la exposición con EFV. Regulación de la expresión de p62 Nuestro siguiente objetivo fue analizar el mecanismo a través del cual se realiza la inducción de p62. EFV provoca un incremento en la concentración del Ca2+ citosólico en células Hep3B debido en gran medida a su papel como inductor de estrés de RE (Apostolova et al. 2013), por lo que decidimos analizar la participación de este ion en el aumento de la expresión de p62. Con la intención de explorar esta posibilidad, las células fueron tratadas con EFV en presencia o ausencia del quelante de Ca2+ intracelular, BAPTA. Los resultados obtenidos muestran que el Ca2+ juega un papel parcial en el incremento de la expresión génica y proteica de p62 producida por EFV, ya que este aumento fue parcialmente revertido en presencia de BAPTA. Varios factores de transcripción se han vinculado con la regulación de la expresión génica de p62, como son Nrf2 y NF-κB (Puissant et al. 2012). Teniendo en cuenta el efecto específico de inducción dual de estrés de RE y disfunción mitocondrial en nuestro modelo, decidimos investigar si la potenciación en la expresión de p62 fue mediada por el factor de transcripción CHOP, conocido por ser activado tanto por estrés de RE como por agentes oxidantes. Para ello, silenciamos de forma transitoria DDTI3 (gen codificante de CHOP) mediante ARN de interferencia (ARNi) y evaluamos los efectos de EFV en estas células. Conviene resaltar que en las células control (no tratadas con EFV o vehículo) el silenciamiento de DDIT3 redujo significativamente la expresión de p62, un efecto que se reprodujo en las células tratadas con EFV, sugiriendo de esta forma que el incremento de la expresión de p62 fue en gran parte mediado por CHOP. La implicación de CHOP en la regulación de la transcripción de SQSTM1 por EFV fue confirmada mediante la realización de un ensayo ChIP, demostrando la interacción de CHOP con el promotor de SQSTM1. Mediante esta técnica además descartamos la participación de Nrf2 y NF-κB en la regulación de p62 en nuestro modelo. Implicación de p62 en la autofagia, función mitocondrial y activación de la respuesta inflamatoria Como se ha mencionado previamente, EFV (10 y 25 µM) induce autofagia en el modelo de células hepáticas empleado en este trabajo de investigación (Apostolova et al. 2011). Teniendo en cuenta que p62 es degradado por autofagia, y que es comúnmente empleado como un marcador de este mecanismo, analizamos la participación de p62 en el proceso autofágico inducido por EFV. Para ello, evaluamos los niveles de LC3-II en células Hep3B silenciadas transitoriamente para SQSTM1 mediante ARNi. El análisis proteico de LC3-II reveló que el silenciamiento de SQSTM1 no afectó a la expresión de LC3-II en células tratadas con EFV ni a los niveles basales de la misma. La ausencia de correlación entre la autofagia y p62 también fue demostrada con otra aproximación, mediante el uso del inhibidor farmacológico de la autofagia 3MA, cuyo co-tratamiento con EFV no tuvo efectos significativos en la expresión génica de p62. Además, decidimos explorar los efectos del silenciamiento de SQSTM1 en la función mitocondrial de células tratadas con EFV. El análisis de dicha función mediante microscopía de fluorescencia, mostró que p62 no está involucrado en la caída en el ΔΨm inducido por EFV; sin embargo, la deficiencia de p62 supuso una potenciación en la producción de ERO de origen mitocondrial en las células tratadas con EFV. Dado que el silenciamiento de SQSTM1 supone un incremento en los niveles de ERO en las células expuestas a EFV, hipotetizamos que p62 podría estar cumpliendo un importante papel en la regulación de la respuesta inflamatoria inducida por EFV en hepatocitos. El análisis de la expresión génica de varios marcadores pro-inflamatorios mostró que el silenciamiento de SQSTM1 potenció significativamente el incremento de la expresión de estos marcadores, concretamente NLRP3, IL1B, IL6 y TNF. Todos estos resultados sugieren que p62 cumple una importante función protectora frente el estrés oxidativo mitocondrial y la activación del inflamasoma en este complejo modelo de toxicidad farmacológica. CONCLUSIONES 1. La disfunción mitocondrial y estrés de RE inducidos por concentraciones clínicamente relevantes de EFV en hepatocitos están asociados con la translocación nuclear de NF-κB, promoviendo la transcripción de citoquinas pro-inflamatorias y componentes del inflamasoma NLRP3. Además, la actividad del inflamasoma NLRP3 está potenciada, incrementado de esta forma la actividad de la caspasa-1. 2. EFV induce disfunción mitocondrial, estrés de RE, y autofagia de lípidos neutros intracelulares en las CEHs, los cuales son importantes eventos celulares implicados en la transdiferenciación fenotípica de las CEHs a miofibroblastos. 3. EFV incrementa la expresión génica de clásicos mediadores fibrogénicos y pro-inflamatorios en las CEHs; además, este fármaco induce la activación del inflamasoma NLRP3 y la secreción de IL-1β. 4. Los efectos pro-inflamatorios y fibrogénicos hallados in vitro en hepatocitos y CEHs, no fueron reproducidos en un modelo murino de exposición aguda a EFV, el cual no mostró daño hepático evidente 5. Los hallazgos in vivo pueden ser debidos a que EFV promueve la polarización de los macrófagos hacia el fenotipo anti-inflamatorio M2, que puede estar mediado por una expresión incrementada de PPAR-γ. Asimismo, la depleción de los macrófagos hepáticos in vivo resulta en la aparición de los efectos encontrados en hepatocitos y CEHs, enfatizando de esta forma el importante papel de los macrófagos en la mediación del daño hepático inducido por EFV. 6. La expresión de p62 es aumentada en hepatocitos tratados con EFV, y esto ocurre a través del factor de transcripción CHOP, mientras que otros reguladores conocidos de esta proteína, tales como Nrf2 y NF-κB no están involucrados. 7. Los niveles incrementados de p62 ejercen un papel protector frente a los efectos producidos por EFV, tales como la producción de ERO mitocondriales y citoquinas pro-inflamatorias, así como la activación del inflamasoma NLRP3, un papel que parece ser independiente de la autofagia.

Efavirenz (EFV) is among the antiretroviral drugs most widely employed against the human immunodeficiency virus (HIV) infection. Despite being considered a safe, highly efficient and well-tolerated drug, there is growing concern about EFV-induced adverse events. It has been associated with hepatotoxic effects, and although the mechanisms involved are yet to be clarified, evidence has shown that in cultured cells, it induces a pattern of actions in hepatocytes, including endoplasmic reticulum (ER) stress and mitochondrial dysfunction, which could underlie induction of hepatic inflammation. The NLRP3 inflammasome is an important regulator of inflammatory and fibrogenic responses in several liver disorders such as drug-induced liver injury, non-specific hepatitis and non- alcoholic steatohepatitis. In the present work, we explore the inflammatory and fibrogenic responses produced by short-term exposure to the antiretroviral drug EFV in major liver cell types -hepatocytes, hepatic stellate cells (HSCs) and macrophages-, by performing in vitro (human hepatic cell lines and primary cells) and in vivo experiments (liver tissue samples from C57BL/6 mice). EFV triggered a pro- inflammatory response in hepatocytes, that involved NF-κB and the NLRP3 inflammasome, and it also activated HSCs, thereby enhancing expression of pro- inflammatory cytokines (such as IL-1β, TNF-⍺, IL-6), components of the NLRP3 inflammasome and purinergic signaling, and fibrogenic (TGF-β1, TIMP-1, MMP- 2, MMP-9 and collagen 1⍺1) mediators in the latter cell type. NLRP3 inflammasome was not altered in EFV-treated macrophages, but these cells polarized towards the anti-inflammatory and pro-resolving M2 phenotype and displayed upregulated anti-inflammatory markers (PPAR-γ, NLRP12 and IL-10). Unexpectedly, no evidence of liver injury was observed in EFV-treated mice, which did not display increases in inflammatory and fibrogenic markers. However, when macrophages were depleted, it resulted in the in vivo manifestation of the deleterious effects detected in hepatocytes and HSCs. Additionally, we explored the role of p62 in EFV-induced hepatocyte damage. SQSTM1/p62 is a stress-induced scaffold protein involved in multiple cellular processes including autophagic clearance, regulation of inflammatory responses and redox homeostasis. Our results show that, despite activation of autophagy, p62 protein content is increased due to enhanced SQSTM1 transcription in hepatocytes. This EFV-induced increase in p62 levels is mediated through the transcription factor CHOP, and not through its traditional regulators, NF-κB and Nrf2. Our data also suggest that p62 exerts a protective function against several EFV-induced actions such as mitochondrial reactive oxygen species production and expression of pro-inflammatory cytokines and components of the NLRP3 inflammasome. In conclusion, EFV elicits a cell-specific activation of pro-inflammatory (including the NLRP3 inflammasome) and pro-fibrogenic pathways in hepatocytes and HSCs. Macrophages appear to counteract these EFV-induced deleterious actions in the liver, by their polarization towards the anti-inflammatory M2 phenotype. In hepatocytes, EFV specifically up-regulates p62, which alleviates the mitochondrial dysfunction and inflammatory response. Considering the previously reported EFV-induced toxic effects on hepatocytes, our findings highlight the dynamic nature of the interaction that takes place among liver cell populations, and may help to understand the variability in adverse hepatic events observed in EFV-treated patients. Convergence with other liver-injury- promoting factors in the HIV-infected population, such as other antiretroviral drugs, co-infections (hepatitis B and/or C) or metabolic co-morbidities, could enhance the deleterious actions of this compound and contribute to the pathogenesis of liver disease