1. Introducción Se cree que las uvas fueron domesticadas entre el Mar Negro e Irán durante el periodo del 7000-4000 aC. Las primeras evidencias de elaboración de vino provienen de la presencia de ácido tartárico en un tarro antiguo que data de 5400 - 5000 aC en el yacimiento neolítico de Tepe en Mesopotamia y de los restos de la extracción del zumo de uva en el yacimiento neolítico de Dikili Tash en Grecia (5000 aC). La colonización de los romanos extendió la elaboración del vino por todo el Mediterráneo; en el 500 aC el vino ya se producía en Italia, Francia, España, Portugal y el norte de África. Posteriormente también fue extendido a los Balcanes, Alemania y otras partes del norte de Europa. En 1530, los conquistadores españoles introdujeron la vid en México, Argentina, Perú y Chile. De la misma manera, en 1655 los holandeses plantaron vides en Sudáfrica (Pretorius, 2000a; Sicard and Legras, 2011). Sin embargo, no fue hasta 1860, cuando Louis Pasteur descubrió que la levadura era la responsable de la conversión del azúcar en etanol y dióxido de carbono, cuando el proceso de elaboración del vino recibió el nombre de fermentación. Con el conocimiento de que la levadura era responsable de la fermentación, los productores podrían controlar el proceso desde la viña hasta la planta embotelladora. Más tarde, en 1890, Müller - Thurgau introdujo el concepto de la inoculación de las fermentaciones con el cultivo de levaduras (Pretorius, 2000). En la actualidad la mayor parte de la producción se basa en el uso de cultivo iniciadores de levaduras seleccionadas como práctica enológica para generar vinos con características deseables y para garantizar la homogeneidad de las cosechas sucesivas. Una de las principales demandas del sector vitivinícola está asociada a resolver los problemas generados por el cambio climático. El disponer de levaduras que produzcan un menor rendimiento en etanol, o que incrementen el contenido en glicerol en los vinos pueden ser buenas estrategias para resolver este tipo de problemas. Además de las características fisiológicas mencionadas, las levaduras también deben adaptarse a las actuales prácticas enológicas. Dentro de estas tendencias se encuentra la realización de fermentaciones a baja temperatura para vinos blancos y rosados, ya que se obtienen vinos con una mayor complejidad organoléptica (Beltran et al., 2006; Molina et al., 2007; Torija et al., 2003). Esta práctica se limita a fermentaciones de vinos blancos y rosados ya que en vinos tintos es necesario el uso de temperaturas más altas (22-28 ºC) para la extracción de los compuestos fenólicos de la piel de la uva. Las bajas temperaturas aumentan no sólo la retención sino también la producción de algunos compuestos volátiles (Killian and Ough, 1979). En estas condiciones se produce una mayor cantidad de compuestos aromáticos, especialmente de ésteres que imparten aromas dulces y afrutados, a la vez que se disminuye la producción de algunos compuestos desagradables, tales como ciertos alcoholes superiores y ácido acético (Beltrán et al., 2006). Otro aspecto interesante es que las bajas temperaturas reducen notablemente el crecimiento de bacterias lácticas y acéticas, lo que facilita el control del proceso (Ribéreau-Gayon et al., 2000). A pesar de que las fermentaciones a baja temperatura presentan ventajas interesantes; esta práctica también tiene algunas desventajas principalmente relacionadas con la disminución de la tasa de crecimiento de las levaduras. La temperatura óptima de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae es alrededor de 32 ºC (Salvadó et al., 2011), por lo que la baja temperatura aumenta la fase de latencia, ralentizando el proceso fermentativo e incluso dando lugar a paradas del mismo (Bisson, 1999). Por otra parte, los factores moleculares y fisiológicos que determinan una mejor adaptación de las diferentes especies a las bajas temperaturas durante los procesos de fermentación no son del todo bien conocidos. Varios estudios han puesto de manifiesto la importancia de la composición lipídica en la respuesta adaptativa de las levaduras a las temperaturas ambientales (Beltran et al., 2008; López-Malo et al., 2013a; Redón et al., 2011; Torija et al., 2003; Tronchoni et al., 2012b). El efecto más comúnmente descrito debido a la bajada de temperatura, es un aumento en el grado de insaturación de los ácidos grasos, que se traduce en un aumento en la fluidez de membrana. Sin embargo, esta respuesta podría no ser universal para todas las levaduras. Existen otras formas de aumentar la fluidez de la membrana, como puede ser disminuir la longitud de cadena de los ácidos grasos. Este efecto ha sido descrito en fermentaciones a escala industrial (Torija et al., 2003; Beltrán et al., 2008). De la misma forma que es importante conocer los factores fisiológicos que intervienen en la adaptación a la baja temperatura, también lo es conocer cuáles son las diferencias en la expresión génica que pueden justificar una mejor o peor adaptación en ambientes fríos. Beltrán et al., (2006) realizó un análisis del transcriptoma utilizando la cepa comercial vínica de S. cerevisiae QA23 en condiciones de fermentación industriales a baja temperatura. Observaron que los genes relacionados con el ciclo celular, el crecimiento celular, el destino celular se expresaban menos en la fase de crecimiento exponencial a 13 ºC comparado con 25 ºC. Mientras que los genes cuya expresión se activaba durante la fase exponencial a 13 ºC eran esencialmente genes del metabolismo lipídico y nitrogenado y genes de transporte de nutrientes, junto con genes de respuesta a estrés ambiental previamente descrita por Gasch et al., (2000). Teniendo en cuenta estos antecendentes, el objetivo global de la tesis es el estudio de las bases moleculares y de los mecanismos fisiológicos que determinan una mayor tolerancia a la baja temperatura en levaduras vínicas. Este objetivo global se abordó en distintos objetivos parciales que corresponden con los cuatro capítulos de la presente tesis. 2. Resultados y discusión CAPÍTULO 1 En este objetivo realizamos un análisis fenotípico de una colección de 27 levaduras vínicas industriales pertenecientes al género Saccharomyces en base a su temperatura de crecimiento. Con el fin de seleccionar dos levaduras que presentaran un comportamiento divergente frente a la baja temperatura. Se llevó a cabo un fenotipado de la colección de levaduras en el rango de temperatura comprendido entre 4-45 ºC tanto en medio mínimo (SD) como en mosto sintético (SM). Se seleccionaron dos cepas, P5 y P24, que presentaban un comportamiento divergente a baja temperatura (15 ºC), pero comportamientos similares a su temperatura óptima de crecimiento (28 ºC). P5 fue seleccionada como la levadura que presentaba un buen comportamiento a baja temperatura mientras que P24 fue seleccionada por presentar un crecimiento más afectado en frío. Para tener un control de que la selección se había realizado correctamente marcamos la cepa P5 con la proteína verde fluorescente (GFP) y realizamos cultivos mixtos (P5/P24) a ambas temperaturas, de manera que pudimos comprobar que a 15 ºC, la P5 se imponía de manera clara a la P24 desplazándola del cultivo, mientras que a 28 ºC los porcentajes de ambas cepas de mantenían cercanos al 50% durante todo el proceso. A continuación, con las cepas seleccionadas, llevamos a cabo fermentaciones en continúo usando la misma velocidad de crecimiento, tanto a baja temperatura como a temperatura óptima. Mediante el uso de este sistema podemos separar los efectos causados por la propia velocidad de crecimiento de cada cepa de los efectos provocados por la baja temperatura. Las células obtenidas se usaron para realizar estudios transcriptómicos y proteómicos, así como la secuenciación de los genomas de ambas cepas. En cuanto a la comparación de los transcriptomas de cada cepa por separado a baja temperatura, obtuvimos 211 y 128 genes diferencialmente expresados en frío en P5 y P24, respectivamente. Cabe destacar que la cepa con un mejor comportamiento a baja temperatura presentaba una respuesta transcripcional más fuerte, como se observa en el mayor número de genes regulados por la temperatura. Sólo 32 de estos genes eran comunes a ambas comparaciones, poniendo de manifiesto el gran carácter cepa-dependiente de la respuesta frente a la baja temperatura. Tanto en las comparaciones dentro de la misma cepa a distintas temperaturas como entre cepas a la misma temperatura, siempre surgían categorías funcionales relacionadas con el metabolismo del azufre y del aminoácido metionina. Además, los genes incluidos en estas categorías se situaban en su gran mayoría dentro de la ruta de captación de azufre, con un mayor número de genes regulados positivamente en la cepa P5. Siguiendo el mismo procedimiento realizamos un análisis proteómico mediante 2D-PAGE y posterior espectrometría de masas. El número de proteínas con una concentración diferencial a baja temperatura fue de 7 y 6 en P5 y P24 respectivamente. Estas proteínas pertenecían principalmente a la glucolisis, el proceso de traducción y respuesta frente a estrés oxidativo. Lo más interesante surgió de la comparación entre ambas cepas a 15 ºC donde, de manera similar al análisis transcriptómico, algunas de las proteínas diferenciales pertenecían a la ruta de captación de azufre. Teniendo en cuanta tanto los datos de expresión como de proteínas, decidimos suplementar a las células con tres de los compuestos finales (S- adenosil metionina, glutatión oxidado y glutatión reducido) de la ruta de captación de azufre para ver su impacto sobre las fermentaciones a baja temperatura. La adición de estos compuestos provocaba, excepto el SAM en P5, una disminución del tiempo de generación, especialmente en P24 que alcanzaba velocidades de crecimiento similares a P5. De la misma manera, testamos la capacidad de recuperación tras un choque con un agente oxidante, y observamos que la cepa P5 también presentaba una mejor recuperación, manteniéndose el comportamiento divergente frente a la baja temperatura también frente al estrés oxidativo. La actividad de esta ruta tiene mucha influencia en otros procesos celulares, muchos de ellos con gran importancia en la adaptación a la baja temperatura como la síntesis de fosfolípidos. Cambios en la composición de la membrana plasmática como respuesta adaptativa al frío han sido ampliamente descritos (Beltran et al., 2006; Henderson et al., 2013b; Redón et al., 2011; Tronchoni et al., 2012b). La fosfatidilcolina (PC) es el fosfolípido más abundante de la membrana (~30%) y es sintetizada de novo a partir de la fosfatidiletanolamina (PE) mediante 3 metilaciones que utilizan como donador de grupos metilo a la S-Adenosilmetionina (Chin and Bloch, 1988). De modo que la alta demanda de PC a baja temperatura podría dar como lugar un incremento en la demanda de SAM y por tanto una mayor activación transcripcional de la ruta de captación de azufre. Otra posible explicación sería que el mayor estrés oxidativo al que se ven sometidas las células a baja temperatura (Ballester-Tomás et al., 2015; Paget et al., 2014; Zhang et al., 2003) haga necesario producir una mayor cantidad de glutatión que ayudaría a mantener el equilibrio redox de la célula. Complementariamente a los análisis transcriptómico y proteómico, se secuenciaron los genomas de ambas cepas y se compararon con la cepa de referencia S288c. Se encontraron 6446 SNPs entre ambas cepas vínicas, un número notablemente pequeño, pero lógico debido a que son cepas que se encuentran filogenéticamente muy próximas. Muchos de los polimorfismos entre ambas cepas se encontraban nuevamente en genes relacionados con la ruta de captación de azufre. CAPÍTULO 2 En base a los resultados obtenidos en el primer capítulo, decidimos estudiar en más detalle la posible correlación entre la respuesta frente a estrés oxidativo y la respuesta frente a la baja temperatura. Para ello realizamos un estudio del comportamiento a baja temperatura (12 y 15 ºC) y frente a distintos oxidantes (H2O2, menadiona, terbutilo y cumeno hidroperóxido) empleando 40 levaduras del género Saccharomyces pertenecientes a diversos procesos y orígenes geográficos. Analizamos el área bajo la curva (AUC) de crecimiento de las distintas levaduras en las diversas condiciones y realizamos un agrupamiento jerárquico de las mismas. El resultado más significativo fue el fuerte agrupamiento que se producía entre las condiciones de baja temperatura y el comportamiento de la población frente al peróxido de hidrógeno. Poniendo de manifiesto la posible existencia de un mecanismo de respuesta común. A continuación, seleccionamos 40 mutantes homocigotos, de la colección de la levadura de laboratorio BY4743, en genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo para realizar un muestreo frente a baja temperatura. Se analizaron diversos parámetros de crecimiento tanto en medio YPD como en mosto sintético (SM) y aquellos mutantes que presentaban un fenotipo más afectado a baja temperatura, pero no a 28 ºC, fueron seleccionados para posteriores estudios. Se seleccionaron 10 genes (TSA1, MUP1, GPX1, GLR1, GRX1, TRX2, TRX3, URM1, SRX1 y AHP1), pertenecientes a diversas rutas metabólicas relacionadas con la respuesta frente a estrés oxidativo, para construir mutantes en el fondo genético de las levaduras vínicas seleccionadas en el capítulo anterior por su comportamiento divergente frente a la baja temperatura. La eliminación de prácticamente cualquiera de los 10 genes en la cepa P24 daba como resultado un fenotipo afectado a baja temperatura. Sin embargo, este efecto fue más acusado en los mutantes para los genes MUP1 y URM1. En el caso de P5, los mutantes que presentaban un mayor retraso en la fermentación a baja temperatura fueron MUP1 y AHP1, aunque este último se encontraba muy afectado también a temperatura óptima, con lo cual no se trataba de un efecto debido a la temperatura. Nuestros resultados corroboran que existe una alta correlación entre la respuesta fisiológica a la baja temperatura y el estrés oxidativo, más concretamente frente al peróxido de hidrógeno. Una posible explicación a este hecho podría ser que el frío provoca una situación de mayor estrés oxidativo, debido a que se produce un desequilibrio redox, que debe ser corregido mediante la regulación dinámica del ratio NAD(P)+/NAD(P)H (Ballester-Tomás et al., 2015; Paget et al., 2014). Nuestro análisis de los mutantes en genes de estrés oxidativo a baja temperatura mostró la importancia de los genes MUP1 y URM1 durante las fermentaciones en mosto sintético. MUP1 codifica para una permeasa de alta afinidad de metionina, implicada también en la captación de cisteína (Kosugi et al., 2001). De nuevo, observamos la importancia de la ruta de captación de azufre a baja temperatura, de modo que el mutante para este transpotador en P5 presentaba un fenotipo muy afectado. URM1 codifica para un modificador post-traduccional de otras proteínas y que también está implicado en la señalización por nutrientes (Goehring et al., 2003). Para esclarecer la posible función de este gen en la adaptación a baja temperatura es necesario realizar más análisis en un futuro. CAPÍTULO 3 Dado que la adaptación a la baja temperatura en levaduras, como una gran parte de los caracteres de interés industrial, está bajo el control de múltiples genes (QTLs), decidimos realizar un mapeo para localizar los genes o regiones genéticas implicadas en esta adaptación. Para ello construimos una población híbrida entre las cepas seleccionadas en el capítulo 1 (P5 y P24) y la sometimos a 13 rondas de esporulación e hibridación con el fin de generar una población final que presentara un genoma mosaico; disminuyendo así el ligamiento entre QTLs cercanos. Para estar seguros de que la recombinación se estaba produciendo de manera efectiva, secuenciamos 6 SNPs situados a lo largo del cromosoma III y reconstruimos los haplotipos de 30 individuos de la población F6. Fuimos capaces de encontrar 27 haplotipos diferentes, comprobando así que el proceso de recombinación estaba ocurriendo de manera eficaz. Una vez conseguida esta población mosaico fue sometida a un proceso de selección en YPD y SM tanto a 15 como a 28 ºC, tras lo cual, todas poblaciones seleccionadas, así como la población sin seleccionar, fueron secuenciadas. A continuación las frecuencias alélicas de las poblaciones fueron comparadas con las de la población sin seleccionar con el fin de encontrar genes o regiones en los cuales se produjera un aumento en la frecuencia alélica y por tanto una fijación de esa variante durante el proceso de selección. Localizamos 4 regiones del genoma en las cuales se producía un cambio en la frecuencia alélica cuando la población era seleccionada en mosto sintético a baja temperatura. Tres de ellas se situaban en las regiones subteloméricas de los cromosomas XIII, XV y XVI y una cuarta localizada en el brazo derecho del cromosoma XIV. En la selección en YPD, solo localizamos un pico que era coincidente con el localizado en SM en el cromosoma XVI. Las regiones subteloméricas son muy difíciles de secuenciar y ensamblar debido a su gran variación, presencia de duplicaciones y zonas con muchas repeticiones con homología entre los distintos cromosomas. Este hecho hace que las regiones cercanas a los telómeros estén incompletas en la mayoría de los proyectos de secuenciación y, por tanto, se dificulta la localización de los genes responsables de un fenotipo localizados en estas zonas. Para validar la importancia de estas regiones en ambas cepas seguimos la estrategia de hemicigosis recíproca (RH), en la cual se utilizan derivados haploides de las cepas parentales, a los cuales se les elimina una de las copias del gen o región en cuestión y se hibrida con el otro derivado haploide sin ninguna deleción. En este caso se eliminaron las tres regiones subteloméricas detectadas tanto en el derivado haploide de P5 como de P24, y se analizaron los fenotipos de los híbridos en una fermentación a baja temperatura. La falta de la zona subtelomérica del cromosoma XVI de P5 causaba un retraso muy importante en la fermentación a baja temperatura pero también a 28 ºC, aunque no de manera tan dramática. La falta de esta misma región perteneciente a la cepa P24 mejoraba el proceso, denotando la presencia en esta región de la cepa P5 de genes con una gran importancia para la fermentación alcohólica a ambas temperaturas. De la misma forma, la falta de la región subtelomérica del cromosoma XIII de P24 daba como resultado un fenotipo afectado a ambas temperaturas. Sin embargo, la falta de esta misma zona de P5 mejoraba el proceso. La única de las regiones subteloméricas detectadas que presentaba una dependencia de la baja temperatura fue la perteneciente al cromosoma XV en la cepa P5, cuya ausencia retrasaba el proceso fermentativo, mientras que la falta de la misma perteneciente a P24 mejoraba el proceso. La región del cromosoma XIV fue la única que no estaba situada en la zona subtelomérica, y para tratar de identificar los genes responsables del fenotipo, se realizaron análisis de RH con los cuatro genes más cercanos al QTL (AGA1, PET494, COQ2 y FPK1). AGA1 es una aglutinina implicada en el proceso de reproducción sexual y su deleción no tenía ningún efecto a baja temperatura. Sin embargo, el análisis de las cepas hemicigotas para cualquiera de los otros genes generaba claras diferencias durante la fermentación a 15 ºC. PET494 y COQ2 son proteínas mitocondriales cuya deleción tanto en P5 como en P24 afecta al proceso fermentativo a ambas temperaturas, pero especialmente a 15 ºC. PET494 es un activador traduccional de una de las subunidades (COX3) de la citocromo c oxidasa (Naithani et al., 2003) mientras que COQ2 es una transferasa que cataliza el segundo paso de la síntesis de la ubiquinona (Ashbysb et al., 1992). La falta de ambos genes hace que la mitocondria funcione de manera incorrecta y las células no puedan respirar. Varios autores han descrito que la falta de mitocondrias funcionales genera fenotipos más sensibles al estrés oxidativo (Grant et al., 1997), de modo que el estrés generado a baja temperatura junto con esta deficiencia podría ser un efecto aditivo, que la levadura no es capaz de contrarrestar. En cuanto al gen FPK1, codifica para una “Ser/Thr protein kinasa” que fosforila varias translocasas de lípidos y, por tanto, interviene en el mantenimiento de la asimetría de la membrana plasmática. La eliminación del alelo del alelo de la cepa P24 no tenía efecto en la cepa hemicigota, sin embargo, la deleción del alelo proveniente de P5 provocaba un retraso de ~340 horas en la fermentación a baja temperatura. Al comparar las secuencias de ambos genes observamos que la cepa P24 presentaba una sustitución aminoacídica (R520K) en este gen, que podría ser el responsable del fenotipo inferior de este alelo. También realizamos análisis de RH construyendo híbridos entre los derivados haploides de las cepas vínicas y los mutantes para los genes situados en las regiones subtelómericas de la cepa de laboratorio BY4741. La capacidad fermentativa de los híbridos generados, los cuales sólo mantenían la copia vínica de cada uno de los genes analizados, fue testada tanto a 15 como a 28 ºC. En el cromosoma XIII, los genes cuya hemicigosis producía haploinsuficiencia en el híbrido de ambas cepas vínicas fueron YMR316C-A, DIA1 y ADH6. YMR316C-A y DIA1 son proteínas de función desconocida, cuyas ORFs se superponen. ADH6 es una alcohol deshidrogenasa. En la región subtelomérica del cromosoma XV, sólo dos genes pudieron ser analizados debido a que los otros genes contenidos en esta región eran esenciales. La hemicigosis de la proteína de función desconocida, YOL159C, afectó severamente a la fermentación en ambas cepas híbridas. En cuanto al cromosoma XVI, la hemicigosis del gen ARR3, una permeasa de membrana plasmática que transporta arsenito y antimonio, también afectaba en ambas cepas. Los genes QCR2, AQY1, YPR197C y ARR1 afectaban a la baja temperatura sólo en el caso de la cepa P5/BY4741, mientras que los genes OPT2, YPR195C e YPR196C afectaban en el caso de la cepa P24/BY4741. QCR2 es un componente de la cadena de transporte de electrones de la membrana mitocondrial interna y AQY1 es una acuaporina. Finalmente, OPT2 es un transportador de oligopéptidos implicado también en el mantenimiento de la asimetría de la membrana plasmática. Este trabajo pone de manifiesto la importancia de las regiones subteloméricas como fuente de variabilidad genética de muchos de los caracteres de importancia industrial (Cubillos et al., 2011). Los genes situados en estas regiones evolucionan más rápidamente que sus homólogos internos, debido a que en estas zonas se producen más fácilmente duplicaciones (Ames et al., 2010). De nuevo, el mantenimiento de una adecuada composición lipídica de la membrana plasmática, así como una eficiente respuesta al estrés oxidativo, se sitúan como mecanismos clave en la adaptación a la baja temperatura. CAPÍTULO 4 En un intento de detectar diferencias metabólicas inter-específicas, llevamos a cabo un estudio proteómico comparando dos levaduras criotolerantes del género Saccharomyces (S. uvarum y S. kudriadzevii) con S. cerevisiae tanto a baja temperatura como a temperatura óptima. Con este fin realizamos fermentaciones en continuo de cada cepa a ambas temperaturas en mosto sintético, y con las células obtenidas utilizamos la técnica iTRAQ, que permite cuantificar el proteoma. Además también analizamos los metabolitos de cada una de las fermentaciones en continuo. En cuanto a las diferencias metabólicas de las tres especies, observamos que S. kudriavzevii es la más eficaz a baja temperatura ya que consume más azúcares y nitrógeno con la menor biomasa. Al comparar los proteomas de la misma especie creciendo a ambas temperaturas, encontramos 32, 129 y 226 proteínas con cambios significativos en su concentración en S. cerevisiae (Sc), S. kudriavzevii (Sk) y S. uvarum (Su), respectivamente. En las tres especies a baja temperatura las categorías funcionales más representativas fueron “Traducción y síntesis proteica” y “Glucolisis y gluconeogénesis”, mientras que a 28 ºC era principalmente la categoría “Metabolismo de aminoácidos”. Aunque la respuesta en las tres especies comprendía en general, los mismos mecanismos, la cantidad de proteínas en cada una de estas categorías era mucho mayor en el caso de las especies criotolerantes que en el caso de Sc. Si comparamos los proteomas de las tres especies a cada una de las temperaturas, es decir, Sc, Sk y Su a baja temperatura y Sc, Sk y Su a 28 ºC, lo que obtenemos es que Sc a baja temperatura se caracteriza por tener mayores cantidades de proteínas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos y de aminoácidos mientras que Sk y Su, de nuevo, presentan grandes cantidades de proteínas relacionadas con la traducción. Para intentar demostrar que la mejor adaptación de Sk y Su a baja temperatura esta principalmente relacionada con una mejor capacidad para iniciar la traducción, decidimos hacer un ensayo en presencia del antibiótico paramomicina. Este antibiótico es un potente inhibidor de la traducción de modo que la levadura que tenga un proceso traduccional más eficiente se verá menos afectada por esta droga. En ambas especies criotolerantes vimos un halo de inhibición a 28 ºC, mientras que a 12 ºC no se encontraban afectadas. Sin embargo, en Sc sucedía lo contrario, y encontramos halo de inhibición a baja temperatura. Estos resultados demuestran que uno de los mecanismos más potentes de adaptación en estas especies es la presencia de una traducción más eficiente que en Sc a baja temperatura y, por tanto, una capacidad de respuesta mucho mayor. 3. Conclusiones Las conclusiones principales que se extraen de esta tesis doctoral son las siguientes: 1. La actividad metabólica de la ruta de asimilación de azufre explica las diferencias fenotípicas en la adaptación de las levaduras a la baja temperatura. Este trabajo es el primero que establece una relación entre esta ruta y la adaptación a la baja temperatura. 2. Los resultados de transcriptómica obtenidos en esta tesis ponen de manifiesto la importancia del metabolismo de los fosfolípidos y del mantenimiento de la asimetría entre la parte interna y la externa de la membrana plasmática en la adaptación a la baja temperatura. El análisis de QTLs reveló la importancia de dos genes implicados en el mantenimiento de la asimetría, FPK1 y OPT2, como responsables del mejor comportamiento a baja temperatura. 3. La rigidificación de la membrana plasmática a baja temperatura dificulta la captación de nutrientes, principalmente compuestos nitrogenados. Este cuello de botella metabólico es contrarrestado por la regulación positiva de genes y proteínas implicados en el metabolismo de aminoácidos, tales como la permeasa de cisteína y metionina MUP1. 4. La baja temperatura aumenta el estrés oxidativo e induce una respuesta antioxidante. En todos los resultados de esta tesis hemos observado la inducción de este mecanismo mediante la regulación positiva de genes y proteínas implicados en esta defensa. La mayor activación de la vía de asimilación de azufre a baja temperatura se puede conectar con la respuesta al estrés oxidativo mediante la síntesis de cisteína y metionina, sustratos de muchos compuestos antioxidantes de las células. 5. Hay una fuerte correlación positiva entre el comportamiento de las células a baja temperatura y su capacidad de hacer frente a una situación de estrés oxidativo en presencia de peróxido de hidrógeno. Esta correlación también es muy interesante desde un punto de vista aplicado, ya que podría ser una característica para futuras selecciones de cepas industriales criotolerantes o para la mejora genética de las mismas. 6. El análisis de QTL mostró la importancia de una mitocondria en buen estado en la adaptación a la baja temperatura. La deleción de dos genes implicados en la cadena de transporte de electrones (COQ2 y PET494) provocó un fuerte deterioro en la actividad fermentativa a baja temperatura. 7. El principal mecanismo común de adaptación al frío observado para las tres especies de Saccharomyces estudiadas (S. cerevisiae, S. kudriavzevii y S. uvarum) fue la inducción de genes y proteínas implicados en la traducción. S. kudriavzevii y S. uvarum presentaron una intensa respuesta proteómica debido a la baja temperatura mediante el aumento de un gran número de proteínas relacionadas con la traducción y este hecho podría ser una de las razones por las que estas levaduras están mejor adaptadas a ambientes fríos. 8. El análisis del proteoma de las tres especies de Saccharomyces también reveló una inducción de enzimas fermentativas y glucolíticas a baja temperatura, siendo mayor este aumento en S. cerevisiae, lo que en parte podría explicar el mayor flujo glucolítico de esta especie. Otra explicación plausible es el desequilibrio redox producido como resultado de la cinética más lenta de las alcohol deshidrogenasas a baja temperatura, que daría lugar a la acumulación de NADH y el bloqueo del flujo glucolítico. 9. El análisis de QTLs y su posterior validación mediante RH resaltó la importancia de las regiones subteloméricas como fuente de variación genética en cepas industriales y la necesidad de invertir esfuerzos en proyectos de secuenciación de estas zonas con nuevas tecnologías que permitan lecturas más largas. 10. La información obtenida en esta tesis es muy útil desde el punto de vista industrial para la obtención de cepas más adaptadas a los procesos de fermentación a baja temperatura. Por ejemplo, el alto porcentaje de heterosis (vigor híbrido) obtenido en el fenotipado de los segregantes P5/P24 puede ser explotado obtener cepas mejoradas a baja temperatura.

Temperature is one of the main relevant environmental variables that microorganisms have to cope with. For the majority of microorganisms, including yeast species, the natural environment exhibits temporal fluctuations in temperature on scales that range from daily to seasonal. Temperature is also a key factor in some industrial processes that involve microorganisms. For instance, low temperatures (10-15 °C) are used in wine fermentations to enhance production and to retain flavor volatiles. In this way, white and rosé wines can be achieved with greater aromatic complexity. However, lowering fermentation temperatures has its disadvantages, including prolonged process duration and a higher risk of halted or sluggish fermentation. Our working hypothesis was that these industrial processes can be optimized by improving our knowledge about the mechanisms that determine a higher capacity to deal with this stress and by providing better-adapted yeasts to ferment at low temperature. In this context, the main objective of this thesis work was to study the molecular and physiological mechanisms involved in the adaptation of wine yeast to low temperatures during the fermentation process. To detect these mechanisms, we followed a global approach by comparing the transcriptome, proteome, whole-genome and QTLs analysis between two strains, selected on the basis of a significant divergent phenotype growing at low temperature among a collection of 27 commercial S. cerevisiae strains. This analysis pointed out a common response between low temperature adaptation and oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae so we aimed to quantify the correlation between recovery after shock with different oxidants and cold, and then to detect the key genes related with this response involved also in cold adaptation. In an attempt to detect inter-specific metabolic differences, we characterized the proteomic landscape of these cryotolerant species grown at 12 ºC and 28 ºC, which we compared with the proteome of S. cerevisiae (poorly adapted at low temperature).