Las levaduras del género Saccharomyces (principalmente Saccharomyces cerevisiae) son las responsables de la fermentación alcohólica (Pretorius, 2000). Aunque S. cerevisiae es la especie más frecuente en fermentaciones vínicas, y modelo de estudio (Pretorius, 2000; Serra et al., 2005; Barrio et al., 2006), también pueden estar presentes durante el proceso especies como S. uvarum (Naumov et al., 2002; Rementería et al., 2003; Demuyter et al., 2004), Saccharomyces paradoxus, aislada de viñedos croatas (Redžepovic et al., 2002) o también híbridos naturales entre especies del género Saccharomyces como S. cerevisiae x S. kudriavzevii (González et al., 2006) y S. cerevisiae x S. uvarum (Le Jeune et al., 2007). S. uvarum es una levadura criotolerante y se caracteriza por presentar perfiles de fermentación con mayor velocidad de consumo de fructosa, menor producción de acidez volátil y mayor producción de glicerol, ácido succínico y alcoholes superiores que S. cerevisiae, lo que la convierte en una especie biotecnológicamente interesante para la industria vínica. S. paradoxus tiene la capacidad de degradar parcialmente el ácido málico y además presenta actividad pectinolítica, dos características que normalmente no se encuentran en las levaduras S. cerevisiae. La degradación del ácido málico puede ayudar a la desacidificación biológica del vino, mientras que la actividad pectinolítica puede contribuir a su clarificación y filtrabilidad. S. kudriavzevii, que sólo se ha aislado en ambientes naturales (Naumov et al., 2000; Sampaio y Gonçalves, 2008; Lopes et al., 2010), se ha mostrado como una levadura criotolerante, con una temperatura óptima de crecimiento de 25ºC y un rango de temperatura de crecimiento entre 6 y 32ºC (Arroyo-López et al., 2009; Salvadó et al., 2011). Aunque nunca ha sido aislada en condiciones de fermentación, sus híbridos (S. cerevisiae x S. kudriavzevii) se han encontrado en procesos industriales. Las cepas de interés biotecnológico son organismos altamente especializados que han evolucionado bajo condiciones ambientales rigurosas en diferentes ambientes creados por los seres humanos. Por lo tanto, la variabilidad fisiológica y genética de las levaduras aisladas de diferentes procesos, está asociada a diferencias en el origen geográfico y en las condiciones de fermentación (temperatura, pH o fuentes de nitrógeno). La composición de azúcares (glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa) es extremadamente variable en la naturaleza y tiene consecuencias significativas sobre la adaptación de las levaduras fermentativas (Querol et al., 2003; Barrio et al., 2006). Se han encontrado diferencias fisiológicas a nivel molecular, lo cual se ha correlacionado con su origen y fuentes de aislamiento (Fay et al., 2005; Liti et al., 2009). La diversidad fisiológica y genética han sido bien estudiadas en levaduras asociadas a diferentes procesos industriales como el vino (Querol et al., 1994; Querol et al., 2003; Alba-Lois et al., 2010; Dequin et al., 2011; Schuller et al., 2012; Franco-Duarte et al., 2014) y la cerveza (Alba-Lois et al., 2010). Sin embargo, se sabe muy poco acerca de otras levaduras de fermentaciones tradicionales de Latino América. El estudio de las propiedades biotecnológicas de estas levaduras aisladas de fermentaciones tradicionales, puede ser muy importante ya que puede dar lugar a nuevas estrategias para la mejora de los procesos industriales. Se han llevado a cabo muchos estudios de expresión génica utilizando microarrays de ADN en cepas de S. cerevisiae para entender mejor los procesos de elaboración del vino (Rossignol et al., 2003; Varela et al., 2005), u otros aspectos como la influencia de la temperatura (Beltrán et al, 2006; Pizarro et al., 2008), el crecimiento o la producción de aroma (Rossouw et al., 2008), la respuesta a estrés (Marks et al, 2008; Erasmus et al., 2003), o la respuesta al agotamiento de nitrógeno (Backhus et al., 2001). Esta técnica también se ha empleado en estudios de expresión en otras levaduras del género Saccharomyces como S. kudriavzevii y S. uvarum, para conocer los mecanismos de adaptación a bajas temperaturas de fermentación (Tronchoni et al., 2014), entender las diferencias en cuanto a la síntesis de aromas (Gamero et al., 2014, 2015) y estudiar los perfiles de expresión de los híbridos entre estas especies (Combina et al., 2012; Gamero et al., 2015). Aunque los microarrays son una tecnología de gran alcance y relativamente barata, tiene varias limitaciones. Una de las más importantes es que los arrays se construyen con el genoma de la cepa de laboratorio S. cerevisiae S288c, y el estudio de la expresión de levaduras con diferencias en su composición genómica podría generar información parcial sobre la expresión génica. Actualmente, y gracias a los avances en las técnicas de secuenciación del ADN, a través de tecnologías de nueva generación, NGS (del inglés Next Generation Sequencing), se han revolucionado campos como los de la genómica y la transcriptómica. Estas tecnologías están permitiendo no solo generar información con altos rendimientos, sino también abrir nuevos horizontes para el entendimiento detallado y global de procesos de expresión génica. La caracterización completa y el análisis global de la expresión génica, aun sin ninguna información genómica previa, es ahora posible a través de la secuenciación directa del ARN, tecnología conocida como RNA-seq (Wang et al., 2009; Garber et al., 2011; Egan et al., 2012; Ward et al., 2012). Esta herramienta transcriptómica cambia la manera de cómo se analizan y comprenden los transcriptomas (Wang et al., 2009). La información obtenida es de gran utilidad para vislumbrar procesos metabólicos y mecanismos de adaptación a las condiciones ambientales a las que se exponen las levaduras. Un aspecto importante de la fisiología de las levaduras está relacionado con el control de la expresión génica. Las diferencias genéticas y los cambios en la estabilidad genómica de las levaduras pueden afectar los procesos fermentativos. Por lo tanto, es importante estudiar los cambios en el número de copias de ADN genómico de las cepas, así como los niveles de expresión de sus genes.

The yeasts within the Saccharomyces genus are responsible for numerous biotechnological processes such as the production of beverages and fermented foods. The adaptation to their environment has been different in diverse species of the genus. S. cerevisiae has been found associated to very diverse fermentation processes including baking, brewing, distilling, wine making, cider production, etc. and also in different traditional fermented beverages and foods around the world. It is also the principal model eukaryotic organism utilized for fundamental research (Mustacchi et al., 2006; Oliver, 2007), and is the yeast best adapted to grow at high temperatures within the Saccharomyces genus, with the highest optimum (32.3°C) and maximum (45.4°C) growth temperatures (Salvadó Z. et al., 2011). Also S. cerevisiae is the species with the highest ethanol resistance (Arroyo-López et al., 2010). Besides its traditional role in baking, brewing and wine making, S. cerevisiae is an attractive host for the production of heterologous proteins. Moreover, most commercial fermentations for the production of bioethanol from hexoses regularly employ highly fermenting strains of S. cerevisiae (Goldemberg, 2007). The cryophilic S. bayanus, although has been found in natural habitat in Far East Asia together with strains of S. cerevisiae and S. paradoxus, also appears associated to different fermentation processes: winemaking (Demuyter et al., 2004, Le Jeune et al., 2007), cider production (Coton et al., 2006, Suárez Valles et al., 2007), brewing, and as grape must contaminants. The type strain of this specie, originally isolated from beer, has been described as a hybrid possessing also nuclear genome from S. cerevisiae (Nguyen et al., 2000, de Barros Lopes et al., 2002, Nguyen & Gaillardin 2005), which led to the proposal of the reinstatement of S. uvarum, a former taxon included in S. bayanus, as a distinct specie (Pulvirenti et al., 2000, Nguyen & Gaillardin, 2005) or as a different variety within S. bayanus (Naumov, 2000). Recently our group (Perez-Través et al., 2014) analysing the genetic variability of the ‘uvarum’ group showing a high intraspecific homogeneity, although a certain degree of interbreeding among the strains of this variety was shown. The situation of the ‘bayanus’ group is more complex. Among the S. bayanus strains, different levels of homozygosity, hybridization and introgression were found, all these strains are hybrids between S. uvarum and S. eubayanus and no pure S. bayanus var. bayanus strain was identified. These S. bayanus hybrids can be classified into two types according to the level of homozygous/ heterozygous, indicating that they have been originated by different hybridization processes. The wild yeast S. paradoxus, the closest relative to S. cerevisiae, according to phylogenetic reconstructions (Rokas et al., 2003), is a natural specie worldwide distributed with a fortuitous presence in fermentation processes. Strains of S. paradoxus have been isolated from natural environments usually associated with tree exudates, the phylloplane or with an unidentified species of Drosophila (Glushakova et al., 2007; Naumov et al., 1997, 1998; Phaff et al., 1956). However, also has been described as the predominant yeast in Croatian vineyards (Redzepovic et al., 2002). S. kudriavzevii species has been mainly isolated in natural environments, like decaying leaves (Naumov et al., 2000) or oak barks (Sampaio & Gonçalves, 2008; Lopes et al., 2010). Nevertheless, strains of the species have also been isolated in commercial fermentations in New Zealand and in Europe (González, 2006, Lopandic et al., 2007). Physiological characterization of S. kudriavzevii strains has showed up its cryotolerance, growing quite well at low temperatures (10-15ºC) (Belloch et al., 2008; Tronchoni et al., 2014). However, S. kudriavzevii participates in hybrid formation with S. cerevisiae and S. bayanus species, which are present in industrial fermentations in central Europe (Masneuf et al., 1998; González et al., 2006, 2007, 2008; Lopandic et al., 2007; Sipiczki, 2008; Dunn et al., 2008; Belloch et al., 2009; Horinouchi et al., 2010; Peris et al., 2012 a and b). Physiological data suggest that Saccharomyces hybrids might have inherited the ability to grow at high temperatures (30-37ºC) and ethanol tolerance from their S. cerevisiae parental and ability to grow at low temperatures (10-16ºC) from their S. bayanus and S. kudriavzevii parental (González et al., 2007; Gangl et al., 2009; Gamero et al., 2013). These physiological characteristics point out Saccharomyces hybrids as better adapted to respond the new winemarkers’ trends, such as conducting wine fermentation at low temperatures, which causes wine aroma improvement (Lambrecht & Pretorius, 2000; Torija et al., 2003; Llauradó et al., 2002, 2005; Novo et al., 2003). Oenological characterization of hybrids between S. cerevisiae and S. kudriavzevii has demonstrated that they are well adapted to ferment at low and intermediate conditions of temperature, giving intermediate or higher amounts of glycerol, less acetic acid and higher amounts of higher alcohols with regard to reference strains of S. cerevisiae and S. kudriavzevii (Gangl et al., 2009; González et al., 2007; Lopandic et al., 2007). Nevertheless, these hybrids show intermediate ethanol tolerances when compared with their parental strains (Arroyo-López et al., 2009; Tronchoni et al., 2009; Arroyo-López et al., 2010). Concerning oenological characterization of natural hybrids between S. bayanus and S. cerevisiae, there is limited information in spite of having been described by some authors in wine and cider (Masneuf et al., 1998; Nguyen et al., 2000). However, artificial S. cerevisiae x S. bayanus hybrids have been constructed and characterized. These hybrids seem to have inherited the cryotolerance from S. bayanus (Kishimoto et al., 1994) and they produce intermediate glycerol concentrations with respect to their parental species (Zambonelli et al., 1997). The rest of the species are not associated with fermentative environments. S. arboricolus was found associated with the bark of two tree species of the family Fagaceae in different regions of China (Wang & Bai 2008), S. cariocanus was isolated from a fruit fly (Drosophila sp.) in Brazil (Naumov et al., 2000a), S. mikatae was isolated from soil and decaying leaves in Japan (Naumov et al., 2000a) and S. eubayanus was found in in Nothofagus (Southern beech) forests in Patagonia (Libkind et al., 2011). Many technologies have been used over the years for the purpose of evaluating the genome composition and measuring gene expression of many Saccharomyces strains. Comparative genomic hybridization (CGH) for genome-wide detection of DNA sequences that vary in copy number among individuals has proven useful in assessing chromosomal regions that are repeatedly gained or lost in Saccharomyces, and the recent availability of next-generation sequencing (NGS) methods has opened up new horizons at the level of gene expression analysis. Thus, the objective of this thesis have been the genomic characterization of different Saccharomyces species and to explore the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces bayaus var. uvarum and Saccharomyces paradoxus strains, isolated from diverse environments with the purpose to detect differences in the expression levels of the homologous genes and specific genes of the new wine species that are not found in S. cerevisiae.