Las proteínas insecticidas vegetativas (Vip) constituyen una nueva familia de toxinas producidas durante la fase de crecimiento vegetativo de diferentes cepas de Bacillus y principalmente por Bacillus thuringiensis (Bt). Esta familia de proteínas está representada por 4 miembros: Vip1, Vip2, Vip3 y la recientemente descrita Vip4. Las toxinas binarias Vip1 y Vip2 son activas contra coleópteros y homópteros; las proteínas Vip3 son activas contra lepidópteros, sin embargo, los insectos diana para la proteína Vip4 no se conocen todavía. La determinación del modo de acción de Vip1 y Vip2 fue fácil ya que mostraron una homología de secuencia significativa con las toxinas clostridiales C2 y C3, respectivamente. Éste no fue el caso de Vip3. Las proteínas Vip3 no han mostrado ninguna homología de secuencia significativa con ninguna de las proteínas descritas en las bases de datos. Tampoco se encontró en su secuencia ningún dominio característico con actividad tóxica conocida, por lo que no se pudo inferir su modo de acción. En este trabajo se estudian las principales etapas del modo de acción de las proteínas Vip3A en un intento de ampliar los conocimientos adquiridos hasta el momento sobre estas proteinas. En el presente estudio se evaluó la estabilidad de Vip3Aa respecto a diversos procesos de purificación, tras lo cual se investigó dos pasos de su modo de acción: la activación por el jugo intestinal de las especies susceptibles Spodoptera frugiperda y Spodoptera exigua y la unión a sus receptores específicos localizados en el intestino medio de S. frugiperda. El efecto de varios protocolos de purificación de Vip3Aa sobre su toxicidad fue analizado utilizando S. frugiperda como insecto control. La proteína Vip3Aa fue estable y retuvo total toxicidad después de los diferentes pasos bioquímicos usados para su purificación. Los bioensayos utilizando la Vip3Aa en forma protoxina mostraron diferencias marcadas en los valores de LC50 (anotados a los 7 y 10 días) entre S. exigua (menos susceptible) y S. frugiperda. Se observó una fuerte inhibición del crecimiento a los 7 d y la mayoría de las larvas vivas detuvieron su crecimiento en el primer estadio larvario (L1). Los valores de LC50 de la '' mortalidad funcional '' (larvas muertas más larvas en L1), medidos a 7 d, fueron similares o incluso inferiores a los valores de la LC50 de la mortalidad a los 10 d. Sin embargo, cuando se utilizó la Vip3Aa activada por tripsina, no se observó inhibición del crecimiento, y ambas especies fueron igualmente susceptibles a esta forma. El procesado de la protoxina de Vip3Aa a la forma activada fue más rápido con el jugo intestinal de S. frugiperda que con el de S. exigua, lo que sugiere que la diferencia en la tasa de activación de Vip3Aa entre las dos especies podría ser la base de la diferencia de susceptibilidad a la protoxina. Por contra, Vip3Ae resultó ser igualmente tóxica para estas dos especies. Se realizaron experimentos de proteolisis para estudiar la estabilidad de las proteínas Vip3A frente a las peptidasas intestinales y observar si las diferencias encontradas podrían explicar las diferencias en la toxicidad contra estas dos especies de Spodoptera. Los resultados indicaron que la activación de la protoxina y la degradación de la banda de 62 kDa tenía lugar a concentraciones más bajas de tripsina para Vip3Aa que para Vip3Ae. El efecto opuesto se observó con la quimotripsina. Cuando se usó jugo intestinal de ambas especies de Spodoptera, las protoxinas Vip3Aa y Vip3Ae fueron inmediatamente procesadas y no se encontró ningun péptido resistente a las peptidasas intestinales en las condiciones experimentales utilizadas. Los experimentos de digestión realizados con las serín peptidasas de S. frugiperda purificadas por cromatografía mostraron que la degradación del fragmento activo de las toxinas Vip3A se debe principalmente a la acción de la peptidasa de tipo quimotripsina catiónica. Aunque los patrones de digestión de las proteínas Vip3A no siempre se correlacionan con la toxicidad; la estabilidad del fragmento de 62 kDa a las peptidasas está de acuerdo con las diferencias intraspecíficas de la toxicidad de la proteína Vip3Aa. La unión in vivo de Vip3Aa al intestino medio de S. frugiperda mediante la localización histológica por immuno-fluorescencia mostró que la Vip3Aa se une a lo largo de toda la superficie apical de la membrana del borde en cepillo de las células intestinales. La presencia ténue de fluorescencia verde en el citoplasma de las células epiteliales parece sugerir internalización de Vip3Aa o un fragmento de la misma. El éxito del radiomarcaje de Vip3Aa ha hecho posible el análisis in vitro de sus características y parámetros de unión. La competencia heteróloga de 125I-Vip3Aa con Vip3Ad, Vip3Ae y Vip3Af mostró que estas proteínas comparten los mismos sitios de unión en S. frugiperda. Por contra, cuando se utilizaron Cry1Ab y Cry1Ac como competidores no se observó unión competitiva. El presente trabajo ayudará a comprender mejor la base molecular de la resistencia a las toxinas Vip3A introducidas recientemente en plantas y así ayudar a diseñar estrategias apropiadas de manejo de resistencia a los insecticidas para uso continuado de las toxinas Bt en cultivos transgénicos.

Vip (Vegetative insecticidal protein) constitutes a new family of insecticidal proteins produced during the vegetative growth phase of different bacillus strains and mainly by Bacillus thuringiensis (Bt). This protein family accounts for 4 members: Vip1, Vip2, Vip3 and the recently described Vip4. The binary toxins Vip1 and Vip2 are found to be active to coleopteran and homopteran insects; Vip3 is active against lepidopterans, however, no target is yet known for Vip4. Determination of Vip1 and Vip2 mode of action was easy since they showed significant sequence homology with the well-known clostridial toxins C2 and C3 respectively. This was not the case of Vip3; no significant sequence homology was found with any of the described proteins in the data bases, and neither any characteristic domain with known toxic activity was found in its sequence. Thus their mode of action couldn’t be deduced. In this work we study the main steps of the mode of action of Vip3A proteins in an attempt to extend the knowledge acquired so far. In the present study we assess the stability of Vip3Aa through its purification process, after which we investigate two steps of its mode of action: the activation by the midgut juice of the susceptible insect strains Spodoptera frugiperda and Spodoptera exigua and the binding to its specific receptors localized in the midgut of S. frugiperda. The activity of Vip3Aa has been tested after different purification protocols using S. frugiperda as a control insect. It was found to be stable and retained full toxicity after the different biochemical steps used for its purification. The bioassays results using the protoxin form of Vip3Aa showed pronounced differences in LC50 values (scored at 7 and 10 days) between S. exigua and S. frugiperda, the former being less susceptible. Strong growth inhibition was observed at 7 d and most live larvae were arrested in the first instar. LC50 values of ‘‘functional mortality’’ (dead larvae plus larvae remaining in the first instar), measured at 7 d, were similar or even lower than the LC50 values of mortality at 10 d. However, when the trypsin-activated Vip3Aa is used no growth inhibition was observed in either species, both were equally susceptible to this form. Processing of Vip3Aa protoxin to the activated form was faster with S. frugiperda midgut juice than with S. exigua midgut juice suggesting that the difference in the activation rate of Vip3Aa between the two species could be the basis of the difference in their susceptibility to the protoxin. In contrast, Vip3Ae was found to be equally toxic to these two species. Proteolysis experiments were performed to study the stability of Vip3A proteins to peptidase digestion and to see whether the differences found could explain differences in toxicity against these two Spodoptera species. Results indicated that activation of the protoxin form and degradation of the 62 kDa band took place at lower concentrations of trypsin when using Vip3Aa than when using Vip3Ae. The opposite effect was observed for chymotrypsin. When processed with the midgut extract from both Spodoptera species, Vip3Aa and Vip3Ae protoxins were readily processed but no peptidase resistant core was observed under the experimental conditions used. Digestion experiments performed with S. frugiperda chromatography-purified digestive serine peptidases showed that the degradation of the Vip3A toxins active core is mainly due to the action of cationic chymotrypsin-like peptidase. Although the digestion patterns of Vip3A proteins do not always correlate with toxicity, the peptidase stability of the 62 kDa core is in agreement with intraspecific differences of Vip3Aa toxicity. The in vivo analysis of Vip3Aa binding to S. frugiperda midgut using immunofluorescence histological localization showed that Vip3Aa bound to the brush border membrane along the entire apical surface. The presence of fluorescence in the cytoplasm of epithelial cells seems to suggest internalization of Vip3Aa or a fragment of it. The in vitro analyses of Vip3Aa binding characteristics and parameters have been made possible by its successful radiolabeling. Heterologous competition using Vip3Ad, Vip3Ae, and Vip3Af as competitor proteins showed that they share the same binding site with Vip3Aa. In contrast, when using Cry1Ab and Cry1Ac as competitors, no competitive binding was observed. The present work will help to better understand the molecular basis of resistance to these toxins recently introduced in plants and thus to help design suitable insecticide resistance management strategies for continued use of Bt toxins in transgenic crops.