La fermentación maloláctica es fundamental para la calidad del vino, especialmente en el vino tinto. Se trata de la transformación del ácido L-málico procedente de las uvas, de un gusto fuerte y áspero, en ácido L-láctico, de gusto más agradable, liberándose además CO2. Esta fermentación puede ser una poderosa herramienta en la elaboración del vino, no solo por reducir su acidez, sino también por influir positivamente en el aroma y perfil sensorial del vino. Esta fermentación es llevada a cabo por bacterias lácticas, pero no siempre se realiza en el momento oportuno ni en las condiciones óptimas, ya que son muchos los factores que influyen en su crecimiento y desarrollo. Una de las estrategias utilizadas para controlar la fermentación de forma adecuada, consiste en la inducción de ésta con la inoculación de bacterias lácticas seleccionadas, principalmente con cepas de Oenococcus oeni. En la actualidad, muchos de los cultivos iniciadores malolácticos de bacterias lácticas disponibles en el mercado presentan problemas de implantación debido a las diferentes condiciones de elaboración y características intrínsecas de los vinos. Las bodegas reclaman nuevos cultivos iniciadores más fáciles de usar y con una mayor eficacia. Y además, con mayor frecuencia, cultivos obtenidos a partir de cepas propias y diferenciales de la bodega. La necesidad de obtener más información sobre la fermentación maloláctica, sobre O. oeni y sobre cómo mejorar los cultivos iniciadores, llevó a desarrollar esta investigación, resultado de un acuerdo entre la Universidad de Valencia y Agrovin S.A. En esta tesis doctoral se ha evaluado la posibilidad de emplear cultivos iniciadores líquidos de O. oeni inoculados directamente en vino y se han ampliado los conocimientos sobre la fermentación maloláctica y O. oeni. Objetivos El objetivo general de esta tesis doctoral ha sido seleccionar cepas de O. oeni y evaluar la efectividad del empleo de cultivos iniciadores líquidos en la inducción de la fermentación maloláctica. Para llevar a cabo este objetivo general, se han planteado los siguientes objetivos específicos: Seleccionar una cepa de O. oeni de la colección Enolab, con el fin de elegir aquella capaz de resistir y crecer en un amplio rango de valores de pH, en elevados niveles de etanol, e incapaz de formar aminas biógenas. Diseñar un medio de cultivo líquido favorable para el crecimiento de O. oeni que permita la producción de altos niveles de biomasa, y al mismo tiempo una adaptación a las condiciones del vino. Llevar a cabo el escalado del proceso de producción para la obtención de niveles industriales de biomasa de O. oeni utilizando el medio de cultivo diseñado. Reducir el contenido de histamina presente en los vinos de una bodega mediante la selección e inoculación de una cepa autóctona de O. oeni cultivada en el medio de cultivo líquido diseñado previamente. Optimizar los procesos de conservación e inoculación de cultivos iniciadores, con el fin de mantener una adecuada actividad maloláctica y viabilidad celular en vino. Desarrollar métodos alternativos de inoculación de cultivos iniciadores malolácticos en vino con el fin de mejorar la adaptación a las condiciones del vino, coinmovilizando O. oeni con Saccharomyces cerevisiae. Metodología y resultados Selección de una cepa de O. oeni como cultivo iniciador maloláctico Se realizó un proceso de selección entre 40 cepas de O. oeni pertenecientes a la colección Enolab. Este proceso se llevó a cabo siguiendo diversos criterios para elegir las mejores desde el punto de vista de actividad maloláctica, como son, capacidad para crecer y desarrollar la fermentación maloláctica en un amplio rango de pHs, alto grado alcohólico y ausencia de capacidad de sintetizar aminas biógenas. Las cepas de O. oeni se cultivaron en MLO con 3 valores de pHs diferentes (3,2, 3,5 y 3,8). Las 12 cepas de O. oeni con mayor crecimiento en los 3 pHs fueron cultivadas en MLO con concentraciones de 9 % y 11 % de etanol (v:v). Los resultados obtenidos mostraron que todas las cepas analizadas fueron capaces de desarrollarse con 9 % de etanol (v:v). Sin embargo, la adición de una concentración mayor de etanol (11 % v:v), mostró diferencias en el comportamiento entre las distintas cepas de O. oeni. Las cepas que presentaron un mayor crecimiento poblacional con un nivel de etanol del 11 % (v:v) fueron E4061, E5003 y E3874. Se analizó la actividad maloláctica de estas 3 cepas a diferentes niveles de pH, mediante un sistema de microplaca y azul de bromofenol. La cepa E5003 mostró los mejores resultados, consumiendo el ácido málico en los niveles de pH más bajos. Con el objetivo de estudiar la formación de aminas biógenas por parte de las 3 cepas seleccionadas, se llevó a cabo el análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución. Para ello, se inoculó el medio de cultivo MDB-mod con 2x107 ufc/mL de estas cepas por separado. Tras 15 días, se analizó el contenido en histamina, tiramina, cadaverina y putrescina. Ninguna de las cepas seleccionadas fue capaz de sintetizar bajo estas condiciones las aminas analizadas. Tras inocular una concentración final de 1x106 ufc/mL de las 3 cepas seleccionadas en vino tinto por separado, se observó que la cepa E5003 mantenía la mejor viabilidad celular y consumía el ácido málico más rápidamente, en 15 días, por lo que fue elegida como cultivo iniciador maloláctico. Diseño de un medio de cultivo líquido para la producción del cultivo iniciador maloláctico Tras la selección de la cepa de O. oeni, se diseñó un medio de cultivo adecuado para el cultivo de las bacterias y producción de biomasa. Los medios de laboratorio suelen producir unas cantidades elevadas de biomasa, pero con una baja o nula capacidad de adaptación de estas células al vino. Con el fin de mejorar estas limitaciones, se diseñó un medio de cultivo que preadaptase las bacterias a un medio hostil como es el vino, pero teniendo en cuenta las condiciones óptimas de crecimiento de la bacteria para conseguir los máximos niveles de biomasa y con una óptima actividad metabólica y viabilidad tras su inoculación en vino. Por ello, se analizaron 27 medios de cultivo, con diferentes pHs, niveles de etanol y concentración de azúcares. El medio de cultivo optimizado (OMP) era el que contenía mosto blanco comercial diluido 1/6, 4 % (v:v) de etanol y pH 3,8. Una vez seleccionada la cepa de O. oeni y diseñado un medio de cultivo apropiado, se realizó el escalado del proceso para la obtención de biomasa suficiente para probar su viabilidad como cultivo iniciador maloláctico en grandes volúmenes de vino. Se efectuó un escalado partiendo de un cultivo de 50 mL con una concentración celular de 1x109 ufc/mL. Este cultivo se inoculó en 500 mL de medio OMP y se incubó hasta llegar a una población final de 1x109 ufc/mL. Una vez conseguida esta biomasa, se inoculó en 8 L de dicho medio de cultivo, obteniéndose el cultivo iniciador líquido para ser inoculado en vino. Durante todo el proceso de escalado, se llevaron a cabo controles de contaminación de los medios de cultivo y cultivos obtenidos. Los resultados revelaron una correcta esterilidad del medio de cultivo y un buen desarrollo de la población de las bacterias producidas. La biomasa conseguida tras el proceso de producción fue elevada, obteniéndose una población de la cepa seleccionada de O. oeni de 1,3x109 ufc/mL en 6 días en el fermentador de 8 L. Con el fin de estudiar la actividad maloláctica del cultivo iniciador, se procedió a la inoculación de vino tinto. Se inoculó el vino con el cultivo procedente del fermentador de 8 L en proporciones de 1/10 y 1/100 y 1/1000 y se midieron las concentraciones de ácido málico y láctico a lo largo del tiempo mediante cromatografía líquida. En todos los casos, se consumió todo el ácido málico presente en el vino tras 6 días de incubación. Se realizó el último paso de escalado del proceso a nivel industrial en Agrovin S.A. Allí, se elaboraron 80 L de biomasa bacteriana para su utilización como cultivo iniciador maloláctico líquido, obteniéndose 1x109 ufc/mL en 6 días en este último paso. Tras el éxito de estos ensayos, la cepa E5003 cultivada en OMP se comercializa como cultivo iniciador maloláctico líquido con excelentes resultados en bodega. La aplicación de este cultivo iniciador maloláctico es mucho más fácil que la de los habituales cultivos iniciadores liofilizados ya que no necesita rehidratación, ni aclimatación y las células están activas, realizando la fermentación maloláctica rápidamente. Diseño de un cultivo iniciador maloláctico para una bodega Frente a la problemática planteada por una bodega de la Denominación de Origen Ribera del Duero, con elevados niveles de histamina en sus vinos, se planteó diseñar una estrategia para disminuir dicha concentración y obtener productos más saludables y con menos barreras para su comercialización y venta. Se buscaron los microorganismos responsables de la síntesis de histamina en los vinos y se seleccionó una cepa autóctona de O. oeni no productora de histamina para su utilización como cultivo iniciador maloláctico propio. Para el aislamiento de la microbiota autóctona, se tomaron muestras de 13 depósitos, antes y después de la fermentación maloláctica, y se sembraron en medio MLO y MRS sólido. Se identificaron 8 perfiles de bandas tras la tipificación mediante la técnica molecular de RAPD-PCR, que correspondieron a 8 cepas diferentes de O. oeni. De las 8 cepas, 3 de ellas fueron capaces de producir histamina en medio MDB-mod. De las cepas no productoras, se seleccionó la cepa de O. oeni V6B1 para constituir cultivo iniciador maloláctico propio para la bodega, ya que además de no producir histamina en MDB-mod estaba presente en los depósitos con el mínimo contenido de esta amina. En la siguiente vendimia, se realizó la producción de biomasa de la cepa seleccionada (V6B1) en el medio OMP siguiendo el escalado descrito anteriormente. Se produjeron 24 L de cultivo iniciador maloláctico para la inoculación un depósito de 200 HL en la bodega. La cinética de crecimiento fue similar a la previamente descrita para la cepa E5003, alcanzándose una concentración de 1x109 ufc/mL. Tras la inoculación del depósito, se analizó la viabilidad del cultivo iniciador, la concentración de histamina y la degradación de ácido málico durante el proceso de vinificación, comparándose con un depósito no inoculado en la misma bodega. En ambos depósitos se llevó a cabo la fermentación maloláctica, pero en el depósito inoculado acabó antes. En ambos casos, durante la fermentación maloláctica, los niveles poblacionales de O. oeni llegaron a 1x107 ufc/mL. Tras la fermentación descendieron, pero aun así las poblaciones superaban 1x105 ufc/mL al transferirse el vino a las barricas. En cuanto a la concentración de histamina, antes de la fermentación maloláctica no se detectó en ninguno de los 2 depósitos. Tras la fermentación, se detectó 5 veces menos histamina en el depósito inoculado. Tras un año de envejecimiento en barrica los niveles de histamina aumentaron en ambos depósitos pero encontramos 3 veces menos histamina en el depósito inoculado que en el no inoculado. Estos resultados mostraron el éxito de la utilización de cultivos autóctonos malolácticos líquidos para la disminución del contenido de histamina. Esta metodología innovadora permite la disminución de aminas biógenas en el vino final, manteniendo la microbiota propia y por tanto conservando la personalidad del vino. Conservación de O. oeni Conservación del cultivo iniciador maloláctico líquido Tras la selección de la cepa de O. oeni E5003 y el diseño del medio de cultivo OMP para el cultivo iniciador maloláctico, se estudiaron diferentes métodos para su conservación. Se comparó la conservación a temperatura de 4 ºC y a -20 ºC, con la liofilización. Tras la aplicación de estas metodologías se analizó la viabilidad de los cultivos a lo largo del tiempo. Mediante la liofilización se observó una gran pérdida de viabilidad inmediata debido al propio proceso de liofilización, pero posteriormente, la viabilidad se estabilizó y se mantuvo en el tiempo. Este método de conservación por tanto, sería el adecuado para la conservación del cultivo durante un largo periodo de tiempo. La congelación a -20 ºC fue la metodología más adecuada para el mantenimiento del cultivo líquido durante 30 días, ya que durante este tiempo presentó los resultados más altos de viabilidad celular, manteniéndose en 7,19x108 ufc/mL. La conservación mediante refrigeración a 4 ºC resultó la mejor opción para tiempos de conservación de entre 2 y 4 meses ya que presentó la mejor viabilidad, manteniéndose en 2,56x107 ufc/mL tras 124 días. Conservación de O. oeni en lías Con la intención de evaluar su idoneidad como alternativa a los cultivos líquidos refrigerados, se estudió la conservación de cultivos de O. oeni en lías procedentes de vino tinto. Este sistema permitiría adaptar las bacterias a las condiciones del vino a la vez que conservarlas durante un largo periodo de tiempo. Con estos objetivos se inoculó la cepa E5003 de O. oeni en tres lías diferentes procedentes de la vinificación de Tempranillo. Se analizó la viabilidad de las bacterias mediante este método de conservación y la actividad maloláctica de las bacterias tras su inoculación en vino. Los resultados mostraron que la viabilidad de O. oeni a lo largo del tiempo dependía del tipo de lías, obteniéndose una mejor respuesta en las lías con alto contenido en polisacáridos. Coinmovilización de S. cerevisiae y O. oeni en material celulósico y almidón La inmovilización de cultivos iniciadores proporciona numerosas ventajas en comparación con la utilización de células libres, ya que el soporte de inmovilización actúa como un agente de protección contra los efectos fisicoquímicos de vino. La inoculación de una elevada concentración de bacterias que permite estos sistemas, proporciona tiempos de fermentación más cortos, la eliminación de la fase de crecimiento y procesos de fermentación en continuo. Del mismo modo, permite una fácil recuperación, regeneración y reutilización del producto. Para este estudio, se utilizaron las cepas de S.cerevisiae AXAZ-1 aislada de uva en Grecia y la cepa de O. oeni E5003. Los resultados obtenidos mediante microscopía electrónica manifestaron el logro de la coinmovilización. Con el fin de comprobar su efectividad en vino, se inocularon 0,3 g y 0,03 g de coinmovilizado en 50 mL de vino y se analizó mediante cromatografía líquida el contenido en azucares, ácido málico y ácido láctico a lo largo del tiempo. Estas fermentaciones se compararon con la inoculación simultanea de células libres de S. cerevisiae AXAZ-1 y O. oeni E5003 en concentraciones de 106 ufc/mL y 107 ufc/mL. Las fermentaciones alcohólica y maloláctica se desarrollaron de forma paralela, consumiéndose el ácido málico en 5 días y los azúcares en 5-6 días, al inocular 0,3 g de coinmovilizado o 107 ufc/ml de células libres, reduciendo de este modo considerablemente el tiempo habitual del proceso de vinificación y permitiendo una rápida estabilización del vino. Al inocular 0,03 g de coinmovilizado en 50 mL de mosto tinto la fermentación alcohólica y maloláctica también se desarrollaron paralelamente, consumiéndose el ácido málico y los azucares en 8 días. Sin embargo al inocular simultáneamente células libres de S. cerevisiae y O. oeni en una concentración de 106 ufc/mL, la fermentación alcohólica tuvo lugar en 8 días pero el ácido málico no fue consumido, de modo que a concentraciones de 106 ufc/mL la coinmovilización es más eficaz que la inoculación simultanea de ambos microorganismos. Conclusiones 1. La cepa de O. oeni E5003 ha sido elegida como cultivo iniciador maloláctico, ya que es capaz de crecer en un amplio rango de pH, en medios con niveles elevados de etanol, no produce aminas biógenas, y presenta la mejor actividad maloláctica y viabilidad celular tras su inoculación en vino. 2. El método de cuantificación de aminas biógenas mediante cromatografía líquida empleado hasta el momento ha sido optimizado utilizando una nueva tecnología de columnas de cromatografía de núcleo duro más rápida y barata. 3. El ensayo basado en microplacas usando azul de bromofenol, como indicador de pH, ha permitido la selección de cepas malolácticas en 24 horas, en términos de degradación de ácido málico. 4. Un nuevo medio de cultivo (OMP) para la obtención de elevadas cantidades de biomasa de O. oeni E5003 ha sido diseñado. La composición del medio de cultivo proporciona niveles poblacionales de 1x109 ufc/mL y permite la adaptación de las bacterias a las condiciones del vino. 5. Se ha escalado el proceso de producción de biomasa de O. oeni utilizando 80 L del medio OMP. El tiempo total de producción son 22 días y la población bacteriana alcanza niveles de 1x109 ufc/mL. 6. Una cepa autóctona de O. oeni (V6B1) de una bodega ha sido seleccionada para ser empleada como cultivo iniciador maloláctico propio, por su alta efectividad maloláctica y su incapacidad para producir histamina. El uso del cultivo iniciador maloláctico líquido permite reducir 3 veces el contenido en histamina en un vino final comparado con un vino no inoculado en la bodega. 7. El método de conservación más adecuado del cultivo iniciador maloláctico de O. oeni E5003 depende del tiempo de almacenamiento del mismo. La liofilización permite la conservación del cultivo largos periodos de tiempo, mientras que la congelación a -20 ºC es óptima para la conservación durante 1 mes. La refrigeración a 4 ºC es adecuada para periodos de almacenamiento de hasta 4 meses. 8. El cultivo iniciador maloláctico liofilizado presenta mejores resultados de actividad maloláctica y viabilidad en vino al ser rehidratado con una solución de fructosa, arginina y acido málico, que al ser rehidratado con NaCl. 9. Un método de conservación alternativo de cultivos iniciadores malolácticos consiste en la conservación en lías de vino tinto. La mejor viabilidad celular se obtiene con lías que poseen un mayor contenido en polisacáridos. 10. El cultivo iniciador generado mediante la coinmovilización de S. cerevisiae y O. oeni en material celulósico y almidón permite una fermentación alcohólica y maloláctica en vino simultáneas, reduciéndose el tiempo de vinificación considerablemente.