Los bioinsecticidas basados en Bacillus thuringiensis (Bt) constituyen una herramienta de gran valor para el control de plagas de insectos, ya que presentan una forma de aplicación muy específica e inocua para los usuarios y el medio ambiente. Entender, tanto el mecanismo de toxicidad de estos bioinsecticidas como la respuesta desencadenada en los insectos diana, tiene como objetivo proporcionar una base útil para el desarrollo de insecticidas mejorados dirigidos contra estas importantes plagas agrícolas, permitiendo ampliar el rango y los niveles de toxicidad de las proteínas insecticidas y abordar problemas como la aparición de resistencia. La presente tesis se ha centrado en el estudio del modo de acción de las toxinas Cry de Bt en insectos coleópteros, orden en el cual el modo de acción de este bioinsecticida está poco estudiado. Para ello se ha escogido dos especies de insecto relevantes en este orden: la especie modelo Tribolium castaneum por su condición de plaga, la disponibilidad de la secuencia de su genoma y las numerosas herramientas genéticas y genómicas desarrolladas en dicho organismo que facilitan enormemente el análisis funcional y Leptinotarsa decemlineata, una de las plagas más importantes a nivel mundial en este orden. En T. castaneum se evaluó la actividad insecticida de diferentes cepas de Bt y se realizó un análisis proteómico global en las larvas del insecto después de ser tratadas con las cepas de Bt productoras de las toxinas Cry3Ba y Cry23/37, que resultaron activas, con el objetivo de identificar proteínas diferencialmente reguladas en respuesta a los tratamientos. Tres proteínas del insecto aumentaron tras los tratamientos y pueden participar en la defensa del insecto y la respuesta inmune, siendo una proteína de hemolinfa de unión a odorantes la que más aumentó. También cabe destacar el papel de la apolipoforina III en la respuesta inmune, cuya actuación vía activación de la cascada de la profenoloxidasa se ha demostrado. Cuatro proteínas disminuyeron tras los tratamientos y pueden estar implicadas en el metabolismo y desarrollo del insecto. También en T. castaneum, se identificaron proteínas de unión de la toxina Cry3Ba en el intestino de las larvas y se confirmó que una E-cadherina y un simportador de sodio-soluto son receptores funcionales de ésta. Un fragmento del simportador que contenía el epítopo de unión a toxinas Cry en otros insectos incrementó la susceptibilidad de las larvas al ser suministrado conjuntamente con la toxina Cry3Ba, confirmando la implicación por primera vez de un simportador de sodio en el modo de acción de Bt. En L. decemlineata, se confirmó la relevancia del motivo de reconocimiento de la toxina Cry3Aa de Bt, tóxica para este insecto, por una metaloproteasa tipo ADAM presente en el epitelio intestinal de las larvas, tanto en la proteólisis de la toxina asociada a la membrana intestinal como en su actividad insecticida. A su vez, la prohibitina 1 presentó capacidad de unión a esta toxina, y resultó ser una proteína esencial para las larvas de este insecto. El tratamiento combinado de la toxina Cry3Aa junto con el silenciamiento del gen codificante de la prohibitina 1 produjo un efecto tóxico sinérgico que puede ser utilizado para el control de esta plaga.

Bacillus thuringiensis (Bt)-based bioinsecticides represent a very specific and an environmentally safe alternative to chemical pesticides. Understanding Bt mode of action and insect response to this enthomopathogenic bacteria and its toxins provides useful information to develop new improved insecticides and avoid insect resistance. This thesis focuses in the study of Bt Cry toxins mode of action in coleopteran insects, a group of insects in which this toxicity mechanism is not well known. We have selected two relevant insect species in this order: the coleopteran model Tribolium castaneum, for its pest condition, genome availability, and abundance of genetic and genomic tools developed in this insect, which makes easier the functional analysis, and Leptinotarsa decemlineata, one of the most important pests in this order. Several Bt strains have been evaluated in T. castaneum and a global proteomic analysis was performed in larvae treated with Cry3Ba and Cry23/37 Bt producing strains, which were found toxic, in order to identify differentially regulated proteins in response to treatments. Proteins showing a statistically significant change in treated larvae compared to non-intoxicated larvae fell into two major categories. Up-regulated proteins were involved in host defense and immune response, among which Odorant binding protein C12 showed the highest change. Remarkably, the participation of Apolipophorin-III in T. castaneum immune response via prophenoloxidase cascade activation was also demonstrated. Downregulated proteins were linked to metabolic pathways affecting larval metabolism and development. In this work, a Cadherin and a Sodium solute symporter have been identified by ligand blot as putative Cry3Ba toxin binding proteins, and their role as functional receptors was also demonstrated. A Sodium solute symporter fragment which contains Cry toxin binding epitope found in other insects enhanced Cry3Ba toxic action, confirming the involvement of a sodium symporter in Bt mode of action for the first time. In L. decemlinetata, the relevance of Bt Cry3Aa membrane associated proteolysis and toxicity through the predicted recognition motif Cry3Aa–ADAM metalloproteinase interaction was assessed. L. decemlineata Prohibitin 1 also bound Cry3Aa toxin and its silencing evidenced this protein is essential to this insect. Cry3Aa and Prohibitin gene silencing combined treatments produced a synergistic effect which reveals an effective strategy to improve crop protection.