El síndrome de Usher (USH) es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva, caracterizada por la asociación de hipoacusia neurosensorial, retinosis pigmentaria y, en ocasiones, alteración de la función vestibular. Clínicamente, el USH se puede clasificar en tres tipos (USH1, USH2 y USH3), principalmente en base a la gravedad y progresión de la hipoacusia y presencia o no de disfunción vestibular. El USH es heterogéneo tanto a nivel clínico como genético y, hasta la fecha, se han descrito 11 genes implicados en la enfermedad. El USH2 es la forma más común y tres son los genes responsables conocidos: USH2A (72 exones), GPR98 (90 exones) y DFNB31 (12 exones). USH2A es responsable de más del 70% de los casos USH2, teniendo una menor implicación los otros dos genes. Hasta esta tesis, no se había realizado un análisis exhaustivo de estos tres genes en pacientes españoles con síndrome de Usher. Por ello, uno de los objetivos fue el análisis molecular de los tres genes USH2 en una cohorte inicial de 88 pacientes con síndrome de Usher. El estudio consintió en el análisis de los exones, más las regiones intrónicas flanqueantes, mediante amplificación por PCR y secuenciación directa por Sanger. El estudio no se limitó a la detección de mutaciones puntuales, las variantes detectadas fueron analizadas con varios programas bioinformáticos para predecir su posible patogenicidad y, cuando fue necesario, se realizaron estudios funcionales para comprobar los efectos predichos. Además también se realizaron análisis de CGH-array (comparative genome hibrydization array) para detectar posibles grandes inserciones/deleciones, que no identifican los típicos análisis por PCR. El estudio se inició con USH2A,y en los pacientes en los que no se encontraron mutaciones en este gen, se continuó con el análisis de GPR98 y DFNB31. Treinta y siete (23 nuevas) mutaciones diferentes se detectaron en USH2A y 7 (5 nuevas) en GPR98. No se detectaron mutaciones en DFNB31. Las mutaciones detectadas fueron de naturaleza muy diversa (cambios de aminoácido, isocodificantes, codones de parada prematuro directos, pequeñas deleciones e inserciones) y en la mayoría de casos las mutaciones fueron privadas, demostrando la elevada heterogeneidad alélica de esta enfermedad. Además, se identificaron dos grandes deleciones gracias al uso de la técnica de CGH-array. En el desarrollo de este estudio se describió por primera vez en el USH, la presencia de una mutación intrónica profunda en el gen USH2A que produce la activación de un pseudoexon. Esta variante fue detectada en 4 pacientes españoles, completando y mejorando de esta forma el diagnóstico molecular del USH. Esta parte del estudio nos permitió estimar la prevalencia de los genes USH2 en población española. USH2A está implicado en un 76% de los casos USH2, seguido de GPR98 con un 5,2%. DFNB31 tiene una menor implicación en nuestra población. CLRN1,es el único gen responsable del USH3 conocido. Sin embargo, se ha publicado que este gen también puede estar implicado en pacientes con USH1 o USH2. El análisis de este gen en una cohorte de 17 pacientes con USH nos ha permitido identificar 2 nuevas mutaciones y confirmar la baja implicación de este gen en pacientes españoles. Debido a la elevada heterogeneidad genética y alélica del USH y al gran tamaño de algunos de los genes implicados, el diagnóstico del USH mediante las técnicas de secuenciación tradicionales resulta una tarea muy laboriosa. En los últimos años, las técnicas de secuenciación de nueva generación se han desarrollado considerablemente y son muchas sus posibles aplicaciones. Nosotros hemos elegido el método de captura de regiones (Nimblegen, Roche) seguido de secuenciación masiva mediante la plataforma GS Junior (454, Roche) para el estudio de los genes Usher y su posible aplicación al diagnóstico. Un total de 19 genes fueron incluidos en el diseño (genes Usher, candidatos y otros implicados en sordera). De media, se obtuvieron cerca de 53Mb de secuencias, con un on target del 52%. La profundidad de cobertura obtenida fue de 77X, superando los 40X necesarios. Para evaluar la sensibilidad y fiabilidad de la técnica, en una primera fase se estudiaron 47 pacientes que tenían analizados previamente algunos de los genes Usher. Esta primera cohorte de pacientes nos permitió establecer los criterios adecuados para los sucesivos filtros que se aplicaron a las variantes obtenidas. Esto se automatizó mediante el diseño de un propio programa bioinformático, llamado GSdot. Solo un 2% de las variaciones conocidas no fueron detectadas por NGS debido principalmente a la presencia de regiones con homopolímeros, problemas de alineamiento o una baja cobertura. También nos permitió detectar mutaciones adicionales en 12 de los 47 pacientes, bien porque las mutaciones no se habían detectado por Sanger o el gen implicado no se había estudiado. Una vez comprobada la validez de la técnica, se estudiaron 13 nuevos pacientes con USH, pero sin ningún gen analizado anteriormente. Se detectaron las dos mutaciones en 10 de los 13 casos y en otros dos pacientes se detectó una variante clasificada como UV3. Además, se estudiaron 11 pacientes con sordera no sindrómica, lo que permitió identificar 3 mutaciones en 3 de ellos. En varios pacientes solo se identificó una mutación, y aunque alguno de ellos pueda ser simplemente portador de una mutación en los genes Usher y las mutaciones responsables estén en otro gen, la mayoría de ellos deben tener una segunda mutación, posiblemente en regiones no analizadas con esta técnica (por ejemplo: regiones intrónicas). En otros pacientes, no se pudo detectar ninguna mutación. En estos casos, el estudio del exoma entero ayudará a encontrar el gen implicado. Aunque es necesario mejorar la técnica, los resultados obtenidos son muy prometedores para una futura traslación al diagnóstico. Esta estrategia facilitará el diagnóstico del USH de pacientes que no presentan mutaciones en los genes principalmente implicados o de aquellos casos que presentan mutaciones en genes típicamente responsables de otro subtipo clínico.

Usher syndrome is a genetic disorder combining sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP). Some patients will also exhibit vestibular areflexia (VA). The majority of patients with Usher syndrome usually fall into one of three clinical categories. Of these, Usher syndrome type I (USH1) is the most severe form, consisting of profound hearing loss and vestibular dysfunction from birth. Moreover, onset of RP occurs earlier in USH1 than in Usher syndrome type II (USH2), which produces less severe congenital hearing loss and does not impair normal vestibular function. In most populations, USH1 accounts for approximately one-third of USH patients whereas two- thirds are classified as USH2. Usher syndrome type III (USH3) is a less common form except in such populations as Finns and Ashkenazi Jews. In this USH3 type, hearing loss is progressive and leads to variable vestibular dysfunction and onset of RP. It is important to use all accessible genetic tools to identify and characterize molecular origin in order to improve the knowledge of the physiopathological mechanisms causing Usher Syndrome. This clinical heterogeneity is accompanied by high genetic heterogeneity. To date a minimum of eleven genes responsible for the disease are known. Five USH1 genes have been extensively studied: MYO7A (USH1B), CDH23 (USH1D), PCDH15 (USH1F), USH1C (USH1C) and USH1G (USH1G), with MYO7A being the most prevalent. A sixth gene, CIB2 (USH1J), has been very recently reported in a single family. Among the three identified USH2 genes, USH2A (USH2A), GPR98 (USH2C) and DFNB31 (USH2D), USH2A has been shown to be responsible for 70-80% of the USH2. Until recently, CLRN1 (USH3A) was the only gene known responsible for USH3 In this context, we have performed an exhaustive molecular analysis of the three causative USH2 genes (USH2A, GPR98 and DFNB31). The study was not limited to the search of point mutations; CGH-array analysis, computational predictions and functional studies were carried out when necessary. Thanks to this work, we determined that in Spain, USH2A and GPR98 are responsible for 94.8% and 5.2% of USH2 mutated cases, respectively. DFNB31 plays a minor role in the Spanish population. USH3 is thought to be a minor type of USH in our population. Mutations in CLRN1 were initially responsible for USH3, but mutations in this gene have also been reported in patients with clinical features similar to USH1 or USH2. In this work, we have reported the results of the molecular analysis of CLRN1 in a cohort of patients and the low involvement of this gene in our population. We have then designed a targeted exome of the Usher genes to be sequenced using the GS Junior system (Roche 454). The aim of the study was to test the feasibility of this new technics for a possible transfer to diagnostic facilities. Quality criteria and variant prioritization were set up on a control cohort (previously studied in one of the USH gene). The study has then been extended on a patient cohort. Our results indicate that NGS Usher-exome can be used in molecular diagnostics but improvement of the reliability of the sequencing technology, bioinformatics tools and dedicated databases is essential.