RESUMEN Introducción: La causa de muerte de la mayoría de los enfermos de cáncer es la metástasis de células tumorales. El melanoma es un modelo muy utilizado para el estudio de la progresión del tumor. La supervivencia y crecimiento de células de MB16 metastáticas está directamente relacionado con el aumento de su contenido en glutatión (GSH). Además dichas células sobreexpresan Bcl-2, mostrando un incremento de GSH sin mostrar un aumento en su síntesis pero sí una disminución en la salida de GSH. Otro punto importante es el GSH mitocondrial (mtGSH), ya que la mitocondria no puede sintetizar GSH. Se ha visto que la depleción de mtGSH facilita la liberación de señales moleculares implicadas en la apoptosis. En trabajos previos de nuestro grupo se demostró en células de tumor ascítico de Ehrlich que L-glutamato (L-Glu) derivado de L-Gln competía con el GSH inhibiendo su transporte al interior de la mitocondria. Objetivos Estudiar los mecanismos de salida de GSH de la célula tumoral para potenciarlos. Disminuir los niveles de mtGSH mediante la utilización de una dieta enriquecida en glutamina (GED). Utilizar dichos mecanismos de depleción de GSH junto con la disminución de la expresión de Bcl-2 para sensibilizar las células tumorales al estrés oxidativo que genera el endotelio y a una posible quimioterapia. Resultados Vimos que la liberación de GSH por las células B16M-F10 se lleva a cabo por dos sistemas complejos: uno dependiente de Bcl-2 y sensible a L-metionina, y otro correspondiente a MRP1. Nos planteamos identificar el mecanismo molecular Bcl-2-dependiente. Se estudió un canal que también está implicado en el flujo de GSH y que en los últimos años se ha visto que se expresa en muchos tipos de células tumorales, investigando su posible relación con los mecanismos ya estudiados. Esta proteína era el regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Se observó que CFTR estaba directamente involucrado en el transporte de GSH desde el citosol al espacio extracelular y correspondía a un canal sensible a Bcl-2. Para potenciar la salida de GSH de las células se probó una combinación de verapamil (VRP, aumenta el transporte de GSH vía MRP1) con un antisentido contra bcl-2 (bcl-2-AS). bcl-2-AS y VRP incrementaron las velocidades de flujo de GSH. El contenido de GSH intracelular disminuyó significativamente en el caso de tratamiento con bcl-2-AS y VRP. Pero, a las 12 horas los niveles de GSH fueron un 70% mayores que los controles en el tratamiento con bcl-2-AS y VRP. Estos resultados mostraban que la pérdida de GSH aceleraba su síntesis intracelular. Vimos que podríamos limitar la síntesis de GSH si conseguíamos inhibir la actividad de la enzima -GT. Con esta idea realizamos experimentos donde inhibíamos dicha enzima mediante la utilización de acivicina (ACV), un inhibidor de la -GT. Con bcl-2-AS, VRP y ACV, la velocidad de síntesis de GSH fue similar a la condición control y la salida de GSH fue tres veces superior al control. la terapia de depleción selectiva de GSH y Bcl-2 presentada aquí, puede potenciarse al combinarla con dosis no tóxicas de TNF- y con GED. Investigamos los efectos de una depleción de mtGSH y un tratamiento con TNF sobre las células B16. El estudio se realizó con células adaptadas a glutamina (B16M-Gln+). Una combinación de GED, TNF- y bcl-2-AS podría teóricamente disminuir la supervivencia de células B16M con alto poder metastático. Se vio que, en células adaptadas a Gln y tratadas con bcl-2-AS, la viabilidad disminuyó un 88%. Con lo que el bcl-2-AS, en células metastáticas adaptadas a la Gln, facilita la citotoxicidad inducida por TNF-. El aumento en la producción de ROS inducido por TNF-, junto con el tratamiento con bcl-2-AS, afectó a la actividad de la superóxido dismutasa (SOD). Al combinar dos oligonucleótidos antisentido (bcl-2-AS y SOD2-AS) para prevenir la resistencia de las células al estrés oxidativo/nitrosativo inducido por el rmTNF-, aumentó la citotoxicidad. Con esta estrategia experimental disminuimos el número de células malignas viables aproximadamente a un 1% de los valores control. Mediante quimioterápicos clásicos conseguimos eliminar in vitro este 1% de células. __________________________________________________________________________________________________

Introduction: The main cause of death from cancer is due to metastases. Malignant melanoma cell subsets show different degrees of multidrug and radiation resistance. Analysis of a Bcl-2 family of genes revealed that B16 melanoma (B16M)-F10 cells (high metastatic potential) have overexpressed preferentially Bcl-2 ( 5.7-fold). B16M-F10 cells show high GSH content and a decrease in GSH efflux. Mitochondria do not synthesize GSH. Mitochondrial GSH (mtGSH) depletion facilitates permeability transition pore complex (PTPC) opening, and the release of apoptosis-inducing molecular signals. In previous studies in Ehrlich ascites tumor cells was found that L-glutamate (L-Glu) derived from L-Gln competitively inhibited GSH transport into mitochondria, depleting selectively tumor mtGSH. Results: We found that GSH release from B16M-F10 cells is channeled through the multidrug resistance protein 1 (MRP1) and the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Bcl-2 inhibits the release of GSH through CFTR facilitating accumulation of GSH within the metastatic cells. Parallel to the Bcl-2-sensitive CFTR, the transport of GSH by MRP1 can carry out by means of a verapamil (VRP)-dependent active transport. We investigate the combination of VRP with a Bcl-2 antisense phosphorothioate-derivatized oligodeoxynucleotides (bcl-2-AS). bcl-2-AS and VRP increased the GSH efflux. Intracellular GSH content decreased in bcl-2-AS- and VRP-treated B16M-F10 cells. However, at 12 h of perifusion time, GSH levels were ~70% higher. These results showed that the loss of GSH content acelerated its intracellular synthesis. tumor -GT activity and an intertissue flow of GSH increase GSH content in B16M-F10 cells. We tested if adding an irreversible -GT inhibitor (acivicin, ACV) we could decrease GSH synthesis. With bcl-2-AS, VRP and ACV treatment, GSH synthesis was similar to control values whereas the GSH efflux increased. We can combinate this selective GSH depletion therapy with non toxic dosis of TNF- and L-Gln enriched diets (GED). So, we investigated a combination of GED, TNF- and bcl-2-AS and found that viability of B16M decreased up to 88% respect control values. The increased of TNF--induced ROS and bcl-2-AS treatment afected superoxide dismutase (SOD) activity. Treating B16Mcells with a double anti- antisense therapy (Bcl-2- and SOD2-AS) and TNF- , metastatic cell survival decreased to 1%. Chemotherapy easily removed this minimum percentage of highly resistant metastatic survivors.