RESUMEN El desarrollo de modelos de toxicidad in vitro es de gran interés en los campos de la Farmacología y la Toxicología bioquímicas tanto para la detección inicial de fenómenos fármaco-tóxicos, como para el estudio de los mecanismos moleculares implicados. Los granulocitos de sangre periférica desempeñan un papel esencial en la inmunidad inespecífica con funciones que implican a la membrana plasmática, las mitocondrias y los lisosomas. Las funciones bioquímicas de los granulocitos de sangre periférica son muy sensibles a los cambios metabólicos en el indivíduo entero y se relacionan con la presencia de diferentes mediadores fisiológicos o moléculas tóxicas circulantes. La citometría de flujo es una técnica muy útil para el análisis multiparamétrico de células individuales y la detección de alteraciones estructurales y funcionales. Por sus características estructurales, los granulocitos son identificados fácilmente por citometría de flujo, permitiendo su análisis específico, sin necesidad de etapas de purificación. Es evidente el beneficio que el ejercicio físico supone sobre prácticamente todos los aspectos de la salud y se han realizado estudios que demuestran que el ejercicio es un regulador de la función inmunológica. Aunque aún existen aspectos poco claros en cuanto a su influencia sobre el sistema inmune, parece existir relación entre la intensidad y duración del ejercicio, y la magnitud y dirección de los cambios en los contajes y porcentajes de los leucocitos circulantes en sangre. Lo mismo sucede con la función aunque las alteraciones funcionales no están relacionadas con los cambios numéricos. El presente trabajo evalúa la utilidad de los granulocitos de sangre periférica como célula diana para el desarrollo de modelos de alteración funcional in vitro que pudieran ser aplicados a la detección de efectos tóxicos, así como al estudio de los mecanismos funcionales implicados en situaciones fisiopatológicas que afecten al Sistema Inmunitario. También se plantea aplicar la capacidad analítica de la citometría de flujo multiparamétrica para el análisis funcional de los granulocitos y la comparación de sus respuestas con la de otras células inmunitarias en los modelos de toxicidad a desarrollar. Se plantea así mismo aplicar los aspectos metodológicos desarrollados al estudio del posible papel del estrés oxidativo en las alteraciones funcionales inducidas en los granulocitos y otras células inmunitarias por el ejercicio físico de alta intensidad. Los objetivos planteados se abordan a través de un estudio integrado, mediante citometría de flujo (EPICS Elite) para el estudio de suspensiones de leucocitos de sangre periférica, obtenidas tras la depleción de hematíes por sedimentación sobre Ficoll-Histopaque y separación celular por "cell sorting". Los granulocitos son identificados y preseleccionados por sus cacterísticas morfológicas, mediante análisis de la dispersión frontal y lateral de luz. Una primera fase in vivo analiza muestras procedentes de indivíduos sometidos a un esfuerzo físico de alta intensidad. El posible papel del estrés oxidativo en las alteraciones funcionales de los granulocitos observadas in vivo, se estudia en una segunda fase en un modelo in vitro de exposición controlada a concentraciones subletales de agentes pro-oxidantes, solubles (como el peróxido de hidrógeno (H2O2)) y de membrana (como el peróxido de tert-butilo (tBOOH)). En las suspensiones de leucocitos aislados se determina el Potencial de Membrana Mitocondrial (PMM, con Rhodamina 123), la generación de H2O2- y Superóxido (con Dihydrodiclorofluoresceina (DHDCF) e Hydroethidina (HE)) y los niveles de Glutation (GSH con Naranja de Mercurio), así como la expresión de CD69 y CD25. La expresión de las β2-integrinas CD18, CD11a, CD11b y CD11c, se han determinado en condiciones basales y tras estimulación con PMA o FMLP. En ambos modelos se analiza la distribución, estado de activación, respuesta mitogénica y generación de especies reactivas de oxígeno en las diferentes subpoblaciones leucocitarias. Los estudios citométricos sobre el modelo in vitro aborda fundamentalmente los fenómenos de expresión de moléculas de adhesión de la familia de las integrinas, en condiciones basales y tras estimulación quimiotáctica o activación de la protein kinasa C, por la especial relevancia de dichas moléculas en la funcionalidad de los granulocitos y su papel en los fenómenos de interacción de los mismos con otras células implicadas en las alteraciones funcionales inducidas por el ejercicio físico intenso. Las determinaciones demuestran que el ejercicio físico intenso induce una disminución en el porcentaje de linfocitos T citotóxicos, linfocitos T inductores de cooperación y células Natural Killer, aumentando el porcentaje de linfocitos T inductores de supresión. En este modelo se produce un incremento de las células T que expresan el receptor de Interleukina-2, acompañado de una mayor capacidad de respuesta a la activación mitogénica in vitro. Sin embargo, dichas células utilizan con menos eficacia la Interleukina-2 exógena, sugiriendo la existencia de interferencias con el mecanismo de transducción de la señal de activación. Además la incubación in vitro con dosis no letales de prooxidantes exógenos induce un estrés oxidativo intracelular en los leucocitos, pero no provoca la activación de los linfocitos. Los prooxidantes exógenos, en general, incrementan la expresión espontánea de moléculas de adhesión, los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno y modifican la sobreexpresión inducida por estímulos quimiotácticos o activadores de la protein kinasa C en granulocitos y monocitos, lo que sugiere la existencia de un posible estrés oxidativo en dichas células y por tanto de un desequilibrio entre prooxidantes y antioxidantes que puede participar en las alteraciones de la función inmunitaria específica e innata. Los granulocitos han respondido de forma más sensible y consistente que los monocitos a la acción in vitro de los oxidantes exógenos. Por último, la utilización de la citometría de flujo multiparamétrica para determinar la funcionalidad de los granulocitos, células fáciles de estudiar selectivamente, podría representar una aproximación de interés para la detección y análisis de fenómenos de citotoxicidad que afecten al Sistema Inmunitario. __________________________________________________________________________________________________

AIMS: To evaluate the utility of whole blood granulocytes as useful cells in the development of in vitro models of functional disturbance in order to detect toxic effects, to study the functional mechanisms of the Inmunitary System and to determine by flow cytometry (CMF) the in vitro effects of oxidative stress on the functional status of leukocytes in whole blood, assessed by analysis of mitochondrial function, intracellular prooxidants, early- and late activation markers and cell adhesion molecules. METHODS: Whole blood samples were in vivo processed by CMF after a high intensity physical exertion and in vitro incubated with sublethal concentrations of soluble (H2O2) and membrane (t-Butyl hydroperoxyde) prooxidants. Mitochondrial membrane potential (MMP, with Rhodamine 123), H2O2- and superoxide generation (with dihydrodiclorofluorescein (DHDCF) and hydroethidine) and glutathione levels (GSH with Mercury Orange) were determined in isolated leukocytes suspensions. CD69 and CD25 expression was determined in whole blood leukocytes. β2-integrins (CD18, CD11a, CD11b and CD11c) were determined in basal conditions and following cell stimulation with PMA or FMLP. All the analysis were performed with an EPICS XL flow cytometer. RESULTS: High intensity physical exertion modified lymphocyte subpopulations with different functional implication and also the activation state of these cells, and increased metabolic activity, basal integrin expression and H2O2 intracellular levels in granulocytes and monocytes. Extracellular prooxidants induced in all leukocytes significant increase of intracellular oxidants and MMP and decreased cell GSH. There were no changes in the distribution of lymphocyte subpopulations. CD69 and CD25 were not affected. The effects on β2-integrins were complex and more significant in granulocytes: in general, low-concentration of prooxidants enhanced basal integrin expression, while higher concentrations tended to decreased the expression. Also, oxidative stress decreased the sttimulatory effect of FMLP and PMA, specially in the granulocyte subpopulations. In all cases, CD11b and CD11c were the most affected molecules by prooxidants. CONCLUSIONS: The effect of intense physical exercise increase T-cells with an IL-2 receptor and more responsive to the mitogenic activation, but used less effectively exogenous IL-2. In intense physical exercise occur functional changes in granulocytes which are evident by increased metabolic activity, basal integrin expression and intracellular levels of reactive oxygen species. Exogenous prooxidants in vitro induce intracellular oxidative stress and have complex effects on the expression of β2-integrins in leukocytes, specially in granulocytes. The use of flow cytometry to determine the functionality of granulocytes could be of interest to detect and study cytotoxicity events that affect the Inmune System.