RESUMEN El ciclo celular en mamíferos está regulado positivamente por holoenzimas formadas por una subunidad reguladora (denominada ciclina) y quinasas dependientes de ciclinas (CDK). Estos complejos ciclina/CDK se activan e inhiben secuencialmente en las diferentes fases del ciclo celular. Las proteínas inhibidoras de las CDKs, CKIs, constituyen una familia importante de supresores de cecimiento celular. La proteína p27Kip1 es una CKI de la familia CIP/KIP que actúa como inhibidor universal de CDKs. Sus niveles son elevados en células en reposo y disminuyen durante la entrada en el ciclo celular inducida por mitógenos. La fosforilación de p27Kip1 en treonina 187 (T187) es un mecanismo importante que regula los niveles de p27Kip1.. La proteína supresora de tumores p53, que puede ser activada en respuesta a determinados insultos celulares, también modula el número de células, regulando negativamente el ciclo celular e induciendo apoptosis. Diversos modelos animales de arteriosclerosis, denudación mecánica y arteriosclerosis por transplante han demostrado que p27Kip1 y p53 protegen frente al desarrollo de lesiones vasculares obstructivas, cuya formación depende en parte de una respuesta hiperproliferativa de células de la pared arterial, principalmente células musculares lisas vasculares (CMLVs) y macrógafos. El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en la elucidación de mecanismos moleculares implicados en el control de la proliferación celular, con especial énfasis en CMLVs en cultivo y modelos animales de aterosclerosis y daño vascular mecánico. Se han perseguido los siguientes objetivos: 1) Estudiar el el mecanismo molecular por el que los agentes citostáticos PCA-4230 y STI571 inhiben la proliferación de CMLVs y células cancerosas (Trabajo 1 y Trabajo 2). 2) Estudiar la importancia de la fosforilación de p27Kip1 en la T187 en la progresión del ateroma inducido por dieta rica en grasa y colesterol en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE-KO) (Trabajo 3) 3) Analizar el papel de la ganancia de función de p53 en la prevención del desarrollo de la placa de ateroma en un modelo de aterosclerosis experimental así como en la protección frente al desarrollo de la neoíntima tras daño mecánico en la arteria femoral de ratones apoE-KO (Trabajo 4). Los resultados de los trabajos 1 y 2 demuestran que la inhibición de E2F y la represión transcripcional de la ciclina A son parte del mecanismo molecular por el que PCA-4230 y STI571 inhiben la proliferación de CMLVs. Además, STI571 también inhibe la activación de las ERK1/2, mientras que la activación constitutiva de estas MAPKs en CMLVs de arteria femoral previene tanto el efecto citostático como su capacidad de inhibir la transcripción del promotor de la ciclina A del STI571. Los resultados del trabajo 3 en el modelo de arteriosclerosis experimental inducida por dieta muestran idéntico tamaño de ateroma, celularidad y tasas de proliferación y apoptosis cuando se comparan ratones apoE-KO con p27T187A-apoE-KO. Además nuestros resultados demuestran que la fosforilación de p27Kip1 en T187 no está implicada en el control de la expresión de p27 en la aorta. Estos resultados contrastan con los de estudios previos de otros investigadores que han implicado este evento de fosforilación con la regulación del ciclo celular y expresión de la proteína p27Kip1 en otros tipos celulares. Por tanto, la relevancia de la fosforilación de p27Kip1 en la T187 parece depender del tipo celular, tejidos y condiciones patofisiológicas, tanto in vitro como in vivo. Los resultados del manuscrito 4 mostraron que la ganancia de fucnión de p53 puede reducir la hiperplasia de la neoíntima tras daño mecánico, pero no tiene efecto sobre la aterosclerosis, por lo que pone de manifiesto importantes diferencias en el papel de p53 en diferentes modelos de daño vascular que pueden tener importantes implicaciones para futuras aplicaciones terapéuticas. __________________________________________________________________________________________________

The mammalian cell cycle is positively regulated by holoenzymes constituted by a regulatory subunit (called cyclin) and a cyclin-dependent kinase (CDK). Cyclin/CDK complexes are sequentally activated and inhibited in different phases of the cell cycle. CDK inhibitory proteins (CKIs) constitute an important family of growth suppressors. The p27Kip1 protein is a CKI that belongs to the CIP/KIP family which acts as an universal CDK inhibitor. Its levels are elevated in quiescent cells and decreased during mitogen-dependent entry into the cell cycle. Phosphorylation of p27Kip1 at threonine 187 (T187) is an important mechanism by which p27Kip1 levels are regulated. The tumour suppressor protein p53, which can be activated in response to several cellular insults, also modulates cell number by negatively regulating the cell cycle and inducing apoptosis. Several animal models of atherosclerois, mechanical injury and transplant-atherosclerosis have demonstrated that p27Kip1 and p53 protect against vascular obstructive lesion development, which depends in part on a hiperproliferative response of arterial wall cells, mainly smooth muscle cells (SMCs) and macrophages. The work carried out in this Doctoral Thesis has been focused in the elucidaton of molecular mechanisms implicated in the control of cellular proliferation, with especial interest in cultured SMCs and murine models of atherosclerosis and mechanical injury of the vessel wall. The following specific objectives were pursued: 1) To study the molecular mechanism by which the cytostatic agents PCA-4230 and STI571 inhibit SMC and cancer cell proliferation (Paper 1 and Paper 2). 2) To investigate whether p27Kip1 phosphorylation on T187 regulates atheroma progression in apolipoptotein E-null mice (apoE-KO) fed a high-fat and cholesterol-rich diet (Paper 3) 3) To analyze in apoE-KO mice the consequences of hightening p53 function on the development of aortic atherosclerosis and neointimal lesions induced by mechanical injury of the femoral artery (Manuscript 4). Results from paper 1 and paper 2 demostrated that E2F inhibition and transcriptional repression of cyclin A contribute to PCA-4230- and STI571-dependent SMC growth arrest. STI571 also inhibited ERK1/2 activation, whereas forced activation of these MAPKs in femoral artery SMCs impaired STI571-dependent inhibition of both cyclin A promoter activity and SMC proliferation. Results from paper 3 in the experimental model of diet-induced atherosclerosis showed identical atheroma size, lesion cellularity, proliferation, and apoptotic rates when comparing apoE-KO and p27T187A-apoE-KO mice. Moreover, our findings demonstrate that phosphorylation of p27Kip1 on T187 was not implicated in the control of aortic p27 expression. These findings are in contrast with previous studies by other investigators that have implicated this phosphorylation event on cell cycle regulation and p27Kip1 protein expression in other cell types. Thus, the relevance of p27Kip1 phosphorylation on T187 level seems to depend on the cell type and tissues and on pathologic conditions both in vitro and in vivo. Results from manuscript 4 revealed that gain of p53 function can reduce neointimal hyperplasia after mechanical injury, but has no effect on atherosclerosis, thus highlighting profound differences in the role of p53 in different models of vascular injury that may have important implications for therapeutic purposes.