RESUMEN Esta tesis versa sobre el estudio de cuatro enzimas que tienen como función específica la síntesis y liberación del anhidridos fosfóricos, y que son cruciales para la biosíntesis de los aminoácidos ornitina/arginina, prolina, lisina e isoleucina, y para la síntesis microbiana de nucleótidos de pirimidina. Previamente a mi incorporación en el laboratorio, éste habia identificado un plegamiento característico y novedoso común a los enzimas carbamato quinasa (Marina, A. et al., 1999; Ramón-Maiques, S. et al., 2000) y acetilglutamato quinasa (Ramón-Maiques, S. et al., 2002). Ambos enzimas, pertenecen al grupo de la Enzyme Commission EC 2.7.2, transferidores de un fosforilo a un grupo carboxilato, y por tanto, con la misión específica de sintetizar anhidridos mixtos carboxílico-fosfórico, en rutas de biosíntesis de aminoácidos. Carbamato quinasa y acetilglutamato quinasa, pertenecen a la familia estructural aminoácido quinasa (Base de datos PFAM, familia PF00696; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), familia que por similitud de secuencia de aminoácidos, incluye además, a los enzimas aspartatoquinasa, glutamato 5-quinasa, UMP quinasa bacteriana y N-acetil L-glutamato sintasa. Dada la similitud de secuencia entre los enzimas de la familia aminoácido quinasa, el laboratorio propuso que el plegamiento de carbamato quinasa y acetilglutamato quinasa iba a ser común al resto de enzimas de la familia y la puesta a prueba experimental de esta hipótesis ha sido uno de los objetivos principales del laboratorio y de mi trabajo. Parte de mi trabajo inicial, se centró en la acetilglutamato quinasa (NAGK), enzima cuya estructura había sido ya determinada a alta resolución (Ramon-Maiques, et al., 2002), por otros miembros del grupo en el que he desarrollado mi trabajo. Mi trabajo en relación con este enzima fue corroborar mediante mutagénesis dirigida, las inferencias funcionales derivadas del estudio estructural previo. Dada la similitud entre acetilglutamato quinasa y aspartoquinasa (AK), otro enzima de la familia amino ácido quinasa, clave en la síntesis de treonina, metionina, lisina e isoleucina, y con gran potencial desde el punto de vista biotecnológico, utilizamos la información estructural de NAGK, para realizar un trabajo de mutagénesis dirigida de aspartoquinasa, cuyos resultados nos permitieron construir un modelo estructural de AK. El tercer enzima que he estudiado, la UMP quinasa, es clave en la síntesis de nucleótidos de pirimidina y presenta la peculiaridad dentro de los enzimas de la familia aminoácido quinasa de sintetizar la formación de un anhidrido fosfórico-fosfórico. Mi trabajo con este enzima se ha centrado en determinar su estructura mediante difracción de rayos X. Por último he estudiado el enzima glutamato 5-quinasa, clave en la síntesis de prolina en microorganismos y plantas, que es tambien clave para la síntesis de ornitina en animales. He determinado la estructura tridimensional de la glutamato 5-quinasa de E. coli mediante difracción de rayos X. El ámbito de estudio con los cuatro enzimas objeto de esta tesis, ha sido siempre el estructural, buscando conectar y asociar rasgos estructurales con comportamiento funcional. El trabajo que he realizado, ha dado lugar a las siguientes publicaciones: - Marco-Marín, C. et al (2003). Journal of Molecular Biology (2003) 334, 459-476. - Marco-Marín, C. et al (2005). Biochim. Biophys. Acta. (2005) 1747, 271-275. - Marco-Marín, C. et al (2005). Journal of Molecular Biology (2005) 352, 438-454. - Marco-Marín, C. et al (2007). Journal of Molecular Biology (2007) 367, 1431-1446. __________________________________________________________________________________________________

This thesis is about four enzymes that synthesize phosphoric anhydrides, and which have key roles on the biosynthetic pathways of ornithine/arginine, proline, lysine and isoleucine, and on the microbial synthesis of pyrimidine nucleotides. A novel and characteristic fold common to the enzymes carbamate kinase (CK) and acetylglutamate kinase (NAGK) had been identified by other members of the laboratory, previously to my incorporation. CK and NAGK belong to the amino acid kinase structural family (PFAM database, PF00696; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), that also includes aspartokinase (AK), glutamate 5-kinase, bacterial UMP kinase and N-acetyl L-glutamate synthase. Based on the sequence similarity of these enzymes, the laboratory proposed a common fold for all of them, equivalent to that previously described for CK and NAGK. One of the main objectives of the laboratory and of my work has been to probe this hypothesis experimentally. Initially, I studied NAGK from E. coli and I corroborated by site-directed mutagenesis, functional inferences derived from the previous structural work. The high similitude between NAGK and AK allowed to perform a site-directed mutagenesis study of AK, and to use the results of this study to build a molecular model of the AKIII from E. coli. The third enzyme that I have studied, UMP kinase, is a key enzyme of the pathway of biosynthesis of pyrimidine nucleotides in bacteria, that different to the other enzymes of the amino acid kinase family, synthetizes a phosphoric-phosphoric anhydride. I have determined the 3D-structure of the UMP kinase from Pyrococcus furiosus using X-ray crystallography, and also of the glutamate 5-kinase fom E. coli, which is a key enzyme of the biosynthesic pathway of proline in microorganisms and plants, and also of ornithine in animals. The work of this thesis is included in the following publications: - Marco-Marín, C. et al (2003). Journal of Molecular Biology (2003) 334, 459-476. - Marco-Marín, C. et al (2005). Biochim. Biophys. Acta. (2005) 1747, 271-275. - Marco-Marín, C. et al (2005). Journal of Molecular Biology (2005) 352, 438-454. - Marco-Marín, C. et al (2007). Journal of Molecular Biology (2007) 367, 1431-1446.