RESUMEN Un previo trabajo de nuestro grupo demostró que la expresión y la actividad de la xantina oxidasa (XO), generan súper oxido en hígado y plasma de animales diabéticos y que esto aumenta el stress oxidativo en esta enfermedad. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio del role de los radicales libres (ERON) generados por la XO en la activación de la cascada de señalización del factor nuclear- κB (NF-κB) a corto plazo y de la inflamación a largo plazo asociado al daño de la diabetes. En el citoplasma p-IKKΒ y p-IκBα están incrementadas en los animales diabéticos. Estos acompañan en el estrato nuclear de hígado de los animales diabéticos de un incremento de NF-κB (la proteina p65). Medimos la expresión hepática de iNOS y COX-2 que están reguladas por el incremento por el factor de trascripción -κB La diabetes induce la activación de NF-kB, la cascada de señalización y por consecuencia la sobra expresión de enzimas inflamatorios. Estos incrementos fueron eliminados con la administración de alopurinol. Hemos visto también un aumento de infiltración de neutrofilos en hígado de animales diabéticos y de presencia en el órgano de muerte celular. En plasma también hemos comprobado un aumento de ALT en los animales diabeticos. A la luz de los resultados obtenidos, podemos extraer las conclusiones que se enumeran a continuación: - El mecanismo de formación de radicales libres en un modelo de diabetes experimental a corto plazoimplica la activación de la xantina oxidasa. La inhibición de la enzima con alopurinol tiene un efecto protector frente al incremento en la oxidación del glutatión sanguíneo y hepático, frente a los niveles de lipoperóxidos y frente al incremento en los oxisteroles en el hígado de los animales diabéticos. - El mecanismo de formación de radicales libres en un modelo de diabetes experimental a largo plazo (28 días) no sólo implica la activación de la enzima xantina oxidasa. Otros mecanismos deben estar implicados. - La diabetes inducida con estreptozotocina provoca un aumento en el marcador de daño hepático alanina aminotransferasa en plasma, y en las áreas de necrosis determinadas mediante tinción con hematoxilina-eosina. La administración de alopurinol previene ambas alteraciones. - La administración de alopurinol no modifica los criterios diagnósticos de la enfermedad: glucosuria o hemoglobina glicosilada, en ninguno de los modelos utilizados (corto y largo plazo). - La vía de señalización de NF-κB se activa en la diabetes experimental. La administración de alopurinol previene la activación de la cascada de señalización de NF-κB. - La administración de alopurinol previene la expresión génica asociada a la activación del factor de transcripción NF-κB. Los niveles citosólicos de iNOS y COX-2 aumentan de forma significativa en el hígado de los animales diabéticos. La administración de alopurinol previene dicho incremento de forma significativa. - La diabetes inducida con estreptozotocina provoca un aumento significativo de la infiltración de neutrófilos y en los niveles de las citocinas pro-inflamatorias IL-6 y IL- 1β en el tejido hepático. Estas modificaciones se previenen de forma significativa con la administración de alopurinol únicamente en el modelo a corto plazo. - La administración de alopurinol puede tener un efecto positivo en la prevención de las complicaciones relacionadas con el estrés oxidativo en la diabetes experimental inducida con estreptozotocina, especialmente en las fases iniciales de la enfermedad. Esta tisis abre la posibilidad de tratar la inflamación a largo plazo y las complicaciones diabéticas con alopurinol __________________________________________________________________________________________________

Previous work from our laboratory showed that the expression and activity of xanthine oxidase, a superoxide generating enzyme, increases in the liver and plasma of diabetic animals and that this is a significant cause of the oxidative stress which occurs in the disease. The aim of this work was to study the role of ROS generated by XO in the activation of cell signalling pathways leading to inflammation and to long term damage associated to diabetes. Cytosolic phospho-IKKβ and phospho-IκBα contents were increased in the diabetic animals. This was accompanied with increased levels of NF-κB (p65 protein content) in liver nuclear extracts. Subsequently the hepatic expression of two inflammatory enzymes, iNOS and COX 2, that are regulated by NF-κB was increased. The diabetes-induced activation of NF-κB signaling cascade and subsequent overexpression of inflammatory enzymes was abolished by administration of allopurinol. Moreover we found an increase in neutrophil infiltration in the liver of diabetic animals and even some level of hepatic necrosis (evidenced by histological examination as well as by an increase in the plasma activity of alanine amino transferase). This was also prevented by administration of allopurinol. These studies open up the possibility of treating inflammatory long term complications of diabetes with allopurinol.